【摘要】：背景急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)早期采取及時的再灌注策略能有效恢復(fù)缺血心肌的血流,但也會導(dǎo)致心肌微循環(huán)不可逆的損傷,其中包括心肌微血管密度的下降。目的探討micro RNA-145(miR-145)對急性心肌梗死后血管新生的影響及靶向調(diào)控機制。方法首先采用miRNA qRT-PCR檢測人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)在100μM和200μM CoCl_2誘導(dǎo)的缺氧狀態(tài)下mi R-145表達(dá)變化。再分別用Ed U摻入試驗、劃痕和Transwell遷移試驗、Annexin V/PI染色、小管形成試驗檢測miR-145在100μM Co Cl_2干預(yù)下對內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、生存和毛細(xì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成的影響。miRanda、mirWalk等生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-145的靶基因及與真核細(xì)胞翻譯起始因子4B(eukaryotic translation initiation factor 4B,eIF4B)3’UTR的結(jié)合位點,并用雙熒光素酶報告試驗驗證兩者的結(jié)合。內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染eIF4B siRNA后Wester blot檢測eIF4B、c-Myc、Hif1α、Vegfa和抗凋亡因子Bcl2的表達(dá),緊接著轉(zhuǎn)染mi R-145后再檢測相關(guān)信號蛋白的變化。最后,在AMI模型小鼠體內(nèi)注射純化的pre-miR-145干擾及對照腺病毒2周,M型超聲心動圖評價小鼠心功能,免疫熒光染色檢測心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡和微血管密度。結(jié)果在100μM CoCl_2誘導(dǎo)的缺氧狀態(tài)下,內(nèi)皮細(xì)胞中miR-145變化不明顯,但在200μM CoCl_2時,其含量持續(xù)、顯著降低(P0.05)。與對照組相比,agomiR-145顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、生存和毛細(xì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成,antagomiR-145則表現(xiàn)為相反的促進效應(yīng)(P0.05)。生物信息學(xué)預(yù)測和雙熒光素酶實驗證實miR-145可靶向結(jié)合eIF4B3’UTR(P0.05)。用siRNA干擾eIF4B表達(dá)后,內(nèi)皮細(xì)胞中c-Myc、Hif1α、Vegfa和Bcl2蛋白均較對照組明顯降低,agomiR-145亦表現(xiàn)為相似的抑制作用,antagomiR-145則促進了它們的表達(dá)上調(diào)(P0.05)。AMI小鼠體內(nèi)干擾miR-145表達(dá)可促進心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖,增加毛細(xì)血管和小動脈密度,改善心臟射血分?jǐn)?shù)等功能指標(biāo)(P0.05)。結(jié)論MiR-145可通過靶向抑制eIF4B及下游的c-Myc/Hif1α信號和抗凋亡因子Bcl2,調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、生存和血管新生。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R542.22
【圖文】：

變性 95℃ 2sec PC退火 60℃ 20sec 退延伸 70℃ 10sec 延：-Rad CFX Manager 3.1 分析數(shù)據(jù)，根據(jù)溶解曲線和擴增和基因擴增效率。根據(jù) 2-△△Ct公式計算各組 miR-145 的標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)量。統(tǒng)計分析采用雙側(cè)不配對 t 檢驗，P<0. CoCl2干預(yù) HUVECs 不同時間后 miR-145 表達(dá)

1.2 200μM CoCl2處理 HUVECs 不同時間后 miR-145 表達(dá)變R-145 expressions in HUVECs intervened with 200μM CoCl2foOne-way ANOVA followed by unpaired t-test: * indicated P<0.0 所示，HUVECs 在 200μM CoCl2干預(yù)時，與對照組 0d達(dá)均發(fā)生持續(xù)性地明顯下調(diào)（P 值均<0.01），并在第 2 iR-145 對內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、凋亡和影響

取出 ECL 發(fā)光試劑，將等體積的 A 液和 B 液避光配成反應(yīng)液，充分混勻石蠟填平的培養(yǎng)皿中滴加適量反應(yīng)液，將 PVDF 膜從 TBST 取出用濾紙吸于石蠟表面，繼續(xù)滴加適量反應(yīng)液，輕輕搖勻，放入 Bio-Rad ChemiDoc T像系統(tǒng)，調(diào)整大小、時間、分辨率等參數(shù)以獲取理想的目的條帶。7）灰度值計算：采用 Bio-Rad Image Lab 軟件分析各目的條帶和內(nèi)參的灰度值，計算兩者，每個目的蛋白重復(fù)統(tǒng)計 3 次，并使用 GraphPad Prism 軟件做數(shù)據(jù)分析。實驗結(jié)果1 生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)合位點

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本文編號：2794713