【摘要】：長期慢性缺氧會引起肺動脈高壓,增高的肺動脈壓力導(dǎo)致右心功能不全。有研究報道,高原型心臟病的發(fā)病關(guān)鍵病理生理學(xué)機(jī)制也在于缺氧性肺動脈高壓(HPH)。了解HPH的發(fā)病機(jī)制是預(yù)防和治療慢性缺氧性肺部疾病導(dǎo)致的右心功能不全和高原型心臟病的關(guān)鍵因素之一。肺動脈高壓的主要病理學(xué)變化特點是缺氧性肺血管收縮和肺血管結(jié)構(gòu)重建。肥厚的肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖,細(xì)胞外基質(zhì)合成增加,血管平滑肌中層肥厚,肺血管重塑過程中平滑肌樣非血管性細(xì)胞的存在可能會導(dǎo)致肺小動脈壁增厚、狹窄內(nèi)徑、肺血管阻力增加,肺動脈壓力升高。長期肺動脈高壓可能導(dǎo)致右心室代償性肥大甚至右心衰竭。肺動脈平滑肌細(xì)胞的異常增殖、凋亡和遷移是肺血管結(jié)構(gòu)重建中最重要的病理生理學(xué)特點。既往研究往往集中在缺氧及缺氧引起的病理生理學(xué)變化及相關(guān)生物活性分子在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和遷移等功能。最近研究結(jié)果顯示,低氧能夠明顯下調(diào)肺動脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)收縮表型標(biāo)記蛋白的表達(dá),然而,這種具體的下調(diào)機(jī)制還不明確。因此,對PASMCs表型轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制的深入研究可以幫助我們解釋其內(nèi)在機(jī)制,包括在缺氧性肺動脈高壓過程中的肺動脈重構(gòu)的機(jī)理。mi RNA是一類具有調(diào)節(jié)功能的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA。據(jù)不完全統(tǒng)計,mi RNA調(diào)節(jié)著人類三分之一的基因。近年來研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與調(diào)節(jié)一些正常生理過程或特定的病理和生理過程。miRNA的作用機(jī)制可以從以下兩個方面來解釋。首先,它通過直接與目標(biāo)mRNA的3′-UTR非翻譯區(qū)結(jié)合降低mRNA的表達(dá),其次,它通過不完全互補(bǔ)配對和抑制翻譯的過程來調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)。幾項研究已經(jīng)表明,miRNAs參與多種生理過程,如細(xì)胞分化,新陳代謝,細(xì)胞凋亡和增殖。也參與調(diào)節(jié)許多其它的病理過程,如腫瘤發(fā)生,炎癥消退和血管增生。第一部分:miR-23a影響缺氧誘導(dǎo)的肺動脈平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化目的:探討miR-23a在缺氧誘導(dǎo)的肺動脈平滑肌表型轉(zhuǎn)換中的作用及低氧狀態(tài)下miR-23a的表達(dá)機(jī)制。方法:膠原酶消化法提取大鼠PASMCs細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)。在PASMCs進(jìn)行缺氧處理(3%o2)后,使用westernblot免疫印跡法檢測培養(yǎng)細(xì)胞中sm-mhc,smα肌動蛋白,calponin-1,和sm22α蛋白的表達(dá)水平。缺氧條件下,使用mir-23amimic轉(zhuǎn)染pasmcs細(xì)胞。edu染色法檢測細(xì)胞增殖活性。結(jié)果:1缺氧對大鼠pasmcs細(xì)胞的影響一般特點及不同mirna的篩選原代大鼠平滑肌細(xì)胞生長在培養(yǎng)瓶中貼壁生長,大部分細(xì)胞呈梭形,胞漿豐富,胞質(zhì)密度高。細(xì)胞呈捆狀平行排列,pasmcs細(xì)胞呈峰谷分布特征。使用sm-α肌動蛋白抗體進(jìn)行免疫熒光染色后,我們觀察到在細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)明亮的綠色絲狀熒光。平均α-肌動蛋白陽性率水平超過95%。與常氧對照組相比,在h24h組中,mir-23a,mir-25,mir-93和mir-106的表達(dá)水平明顯增高。與常氧(n24h)組相比,mirna表達(dá)水平明顯增加,其表達(dá)水平是常氧組的5.1倍。但mir-143和mir-145表達(dá)水平無明顯變化。觀察缺氧處理48h后mir-23a表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),結(jié)果表明,缺氧48h后(h48h),與常氧組(n48h)相比,mir-23a表達(dá)水平升高約3.8倍。2缺氧對大鼠pasmcs收縮表型標(biāo)志蛋白表達(dá)及pasmcs增殖的影響在常氧對照組和缺氧處理組的肺動脈平滑肌細(xì)胞(3%o2,24h或48h)中,檢測sm-mhc,smα肌動蛋白,calponin-1和sm22α的表達(dá)水平。結(jié)果表明,sm-mhc,smα肌動蛋白,calponin-1,和sm22α的表達(dá)水平在h24h組明顯低于正常對照組(p0.05)。缺氧處理48h后,在pasmcs收縮表型標(biāo)記蛋白明顯低于對照組(n48h)。提示,大鼠pasmcs在缺氧刺激下發(fā)生表型轉(zhuǎn)化。使用edu染色法觀測常氧及3%o2乏氧狀態(tài)下培養(yǎng)的大鼠原代pasmcs細(xì)胞的增殖活性。乏氧處理后,edu染色48h陽性率(h48h)明顯低于常氧對照組,表明缺氧處理能顯著增強(qiáng)pasmcs的增殖活性。3pasmcs細(xì)胞中,mir-23a在缺氧誘導(dǎo)的收縮表型標(biāo)記蛋白的表達(dá)下調(diào)的作用與轉(zhuǎn)染空載體mirna的細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染mir-23a抑制劑后,收縮蛋白(sm-mhc,sma肌動蛋白,calponin-1,sm22α)表達(dá)水平明顯上調(diào)(p0.05)。在轉(zhuǎn)染mir-23amimic的pasmcs細(xì)胞中,檢測發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染后48h,收縮蛋白標(biāo)記物表達(dá)水平明顯下調(diào)(p0.05)。4mir-23a在缺氧誘導(dǎo)pasmcs增殖活性增強(qiáng)中的作用缺氧條件下,肺動脈平滑肌細(xì)胞edu染色陽性率在vehicle和inhibitorctrl組之間中無顯著性差異。在轉(zhuǎn)染mir-23ainhibitor的pasmcs細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染mir-23a抑制劑后48h,edu染色陽性率明顯減低,這一結(jié)果表明,mir-23a在促進(jìn)pasmcs缺氧誘導(dǎo)增殖活性中具有重要的作用。在轉(zhuǎn)染mimic對照組的pasmcs細(xì)胞中,edu染色陽性率與空白組相比,二者未見明顯統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。轉(zhuǎn)染mir-23amimic48h后,與轉(zhuǎn)染mimic對照組相比,pasmcs細(xì)胞edu染色陽性率增加(p0.05)。這一結(jié)果表明,常氧條件下過表達(dá)mir-23a可誘導(dǎo)pasmcs細(xì)胞增殖明顯增加。小結(jié):缺氧狀態(tài)下,pasmcs收縮表型標(biāo)記蛋白明顯降低,表明缺氧處理能顯著增強(qiáng)pasmcs的增殖活性。缺氧處理后,mir-23a表達(dá)水平升高,并且能夠下調(diào)收縮表型標(biāo)記蛋白的水平,說明其在促進(jìn)pasmcs缺氧誘導(dǎo)增殖活性中具有重要的作用。第二部分:mir-23a在缺氧肺動脈平滑肌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的作用機(jī)制目的:探討mir-23a在缺氧情況下表達(dá)水平上調(diào)的調(diào)控機(jī)制及其病理生理學(xué)意義。方法:先在缺氧條件下使用hif-1αsirna及空白對照sirna進(jìn)行pasmcs細(xì)胞轉(zhuǎn)染;轉(zhuǎn)染后連續(xù)培養(yǎng)pasmcs細(xì)胞48h后,再使用rt-qpcr方法檢測pasmcs細(xì)胞中mirna的表達(dá)水平;使用chip方法來驗證hif-1α結(jié)合位點;使用雙熒光素酶報告基因方法來研究hif-1α及其結(jié)合位點的作用。結(jié)果:1hif-1α在缺氧誘導(dǎo)的mirna-23a表達(dá)上調(diào)中的調(diào)控作用在缺氧條件下,使用hif-1αsirna轉(zhuǎn)染pasmcs細(xì)胞后,mir-23a表達(dá)水平明顯減低。這一結(jié)果表明,缺氧條件下mir-23a表達(dá)上調(diào)與hif-1α有關(guān)。在edhb(500μm)24h(edhb24h)組中,與對照組相比,常氧培養(yǎng)pasmcs細(xì)胞hif-1α蛋白水平和mir-23a表達(dá)水平明顯增高。pri-mir-23a-1,pri-mir-23a-2及pri-mir-23a-3含量的變化反映出mir-23a-1,mir-23a-2,mir-23a-3轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)。當(dāng)pasmcs在缺氧條件下培養(yǎng)并使用hif-1α特異性sirna轉(zhuǎn)染后,pri-mir-23a-1和pri-mir-23a-3表達(dá)水平明顯降低,這一結(jié)果表明,hif-1α參與mir-23a-1和mir-23a-3轉(zhuǎn)錄的激活作用。2檢測hif-1α與mir-23a-1和mir-23a-3的上游5kb起始區(qū)的結(jié)合情況。在pasmcs細(xì)胞中,與缺氧處理前(n組)相比,缺氧24h(h24h)和48h(h48h)后,三個調(diào)節(jié)mir-23a-1非翻譯區(qū)的上游5kb預(yù)測位點(r1,r2,r3)與hif-1α結(jié)合力明顯增強(qiáng)。在r1中,hif-1α富集程度最高。與常氧對照組(n)相比,缺氧24h組(h24h)和缺氧48h組(h48h)中,mir-23a-3的非翻譯區(qū)與hif-1α結(jié)合明顯增強(qiáng),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。3使用chip法檢測hif-1α在mir-23a-1和mir-23a-3轉(zhuǎn)錄激活中的作用為了進(jìn)一步闡明缺氧對hif-1α在mir-23a-1和mir-23a-3基因轉(zhuǎn)錄活性的影響,使用野生型受體基因載體(wt)或突變(m1,m2,m3)及hif-1α過表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,在缺氧條件下(1%o2濃度)分別轉(zhuǎn)染hek293ft細(xì)胞。結(jié)果表明,使用m1,m2,m3突變載體轉(zhuǎn)染后,報告基因活性明顯下降。轉(zhuǎn)染m3的突變載體報告基因活性水平最低。缺氧可以明顯增加野生型luc-mir-23a-1(wt)熒光素酶活性,但對于突變型luc-mir-23a-1m3(m3)的熒光素酶活性無明顯影響。此外,野生型和突變型報告基因載體和hif-1α過表達(dá)質(zhì)粒及其對照載體共轉(zhuǎn)染293ft細(xì)胞。結(jié)果顯示,過表達(dá)hif-1α可以明顯改善野生型luc-mir-23a-1熒光素酶活性(wt)(1.7倍),但對luc-mir-23a-1m3突變組的熒光素酶活性沒有明顯影響(m3)。低氧條件下,干預(yù)hif-1α能夠顯著削弱野生型luc-mir-23a-1(wt)熒光素酶活性增強(qiáng)作用。對于mir-23a-3,缺氧條件下(1%氧濃度)與hif-1α過表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染兩種情況,能分別提高野生型luc-mir-23a-3熒光素酶活性(wt)2.8倍和1.8倍,但對luc-mir-23a-3突變沒有影響(m)。缺氧條件下干預(yù)hif-1α在能夠顯著削弱野生型luc-mir-23a-3活性(wt)報告基因的活性。這些結(jié)果表明,缺氧可以明顯上調(diào)mir-23a-1和mir-23a-3的表達(dá)水平,這是由于hif-1α轉(zhuǎn)錄激活發(fā)揮作用。小結(jié):缺氧條件下mir-23a表達(dá)上調(diào)與hif-1α表達(dá)水平有關(guān),hif-1α可以參與mir-23a-1和mir-23a-3的轉(zhuǎn)錄激活作用。mir-23a在缺氧下表達(dá)增加主要是由于mir-23a-1和mir-23a-3上調(diào)引起。缺氧可以明顯上調(diào)mir-23a-1和mir-23a-3的表達(dá)水平,這是由于hif-1α轉(zhuǎn)錄激活發(fā)揮作用。第三部分:慢性缺氧下大鼠肺中小動脈mir-23a表達(dá)水平、肺動脈平均壓、右心室重量指數(shù)及肺動脈形態(tài)學(xué)的變化目的:構(gòu)建大鼠肺動脈高壓模型,探討慢性缺氧狀態(tài)下肺動脈平滑肌細(xì)胞mir-23a的表達(dá)水平及低氧對大鼠肺動脈平均壓,右心室重量指數(shù)以及肺小動脈壁,內(nèi)膜中層厚度的影響。以期在動物模型中進(jìn)一步闡明慢性缺氧的病理生理學(xué)意義。方法:ch組大鼠和常氧下喂養(yǎng)的對照組大鼠(nc組)分別放在模擬海拔5000米的低壓氧艙(thermoscientific,waltham,ma)中喂養(yǎng)21天及正常氧壓條件下喂養(yǎng)。每組隨機(jī)選擇8只大鼠。每只大鼠腹腔注射10%烏拉坦(1ml/100g),處理后大鼠被固定到一個平臺上,分離右側(cè)頸外靜脈。每只大鼠靜脈注射肝素生理鹽水溶液(0.2ml/100g/100g體重)進(jìn)行全身抗凝。自右心室進(jìn)行肺動脈插管(0.45mmid和0.8mmod),使用動力實驗室多導(dǎo)生理記錄儀測量大鼠平均肺動脈壓(mpap)。處死大鼠,開胸切除心臟。將心房和結(jié)締組織仔細(xì)分離。沿室間隔游離右心室游離壁。用下列公式計算右心室重量指數(shù):右心室重量/(左心室+室間隔)重量。結(jié)果:1慢性缺氧對肺動脈平均壓(mpap),右心室重量指數(shù)及肺小動脈壁、內(nèi)膜中層厚度的影響。在慢性低氧組(ch)中,肺動脈平均壓明顯升高(p0.05),比對照組增加約2倍。提示慢性低氧可顯著提高肺動脈壓。在慢性缺氧組大鼠(ch)中,與常氧對照組(nc)相比,rv/(lv+s)明顯增加(p0.05)。提示慢性缺氧可導(dǎo)致大鼠右心室肥厚。我們測量了血管外徑和管壁厚度(外徑-內(nèi)徑),及內(nèi)膜中層厚度。結(jié)果表明,在常氧對照組大鼠(nc)通常肺動脈壁較薄,管腔較大,外徑為81.31±2.8μm,管壁厚度為10.57±2.6μm,內(nèi)膜中層厚度為3.6±0.8μm(表1)。而在慢性缺氧組(ch)大鼠中,肺小動脈外徑為86.61±6.1μm,管壁厚度為21.3±4.4μm,內(nèi)中膜厚度為8.8±1.6μm。2慢性缺氧狀態(tài)下肺小動脈miR-23a的表達(dá)水平在慢性缺氧組(CH)中,與常氧對照組(NC)相比,肺小動脈mi R-23a表達(dá)水平明顯增加(P0.05)。小結(jié):慢性缺氧可導(dǎo)致肺小動脈miR-23a表達(dá)水平明顯增加,并引起大鼠右心室肥厚。慢性缺氧可顯著提高肺小動脈壁的厚度,導(dǎo)致管壁內(nèi)側(cè)平滑肌細(xì)胞增殖及肺小動脈重構(gòu)。結(jié)論:缺氧狀態(tài)下,PASMCs收縮表型標(biāo)記蛋白明顯降低,mi R-23a表達(dá)水平升高,并且能夠下調(diào)收縮表型標(biāo)記蛋白的水平,說明其在促進(jìn)PASMCs缺氧誘導(dǎo)增殖活性中具有重要的作用。HIF-1α參與了miRNA-23a表達(dá)上調(diào)的調(diào)控作用。miR-23a參與低氧性肺動脈高壓發(fā)病機(jī)制,有可能成為治療低氧性肺動脈高壓的靶向藥物。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R544.1
【圖文】：

缺氧對大鼠PASMCs細(xì)胞的影響一般特點及不同miRNA的篩選Fig.1EffectofanoxiaonthegeneralcharacteristicsofratPASMCsandscreeningofdifferentiatedmiRNA.

圖2 miR-23a在低氧誘導(dǎo)的肺動脈平滑肌細(xì)胞收縮表型標(biāo)記蛋白下調(diào)中的作用Fig.2 Role of miR-23a in anoxia-induced downregulation of thecontractile phenotype marker proteins in PASMCs.Note: (A) Detecting the expression of the SM-MHC, SM-α-actin, calponin-1and SM22α proteins with western blot analysis when PASMCs weretransfected with miR-23a inhibitor under anoxia. Compared to the controlgroup, *P<0.05. (B) Detecting the expression of the SM-MHC, SM-α-actin,calponin-1 and SM22α proteins with western blot when PASMCs weretransfected with miR-23a mimic under normoxia，analysis with β-actin as theinternal reference protein. Based on a comparison with the control group,*P<0.05. (C) Detecting the proliferative activity of PASMCs transfected withmiR-23a inhibitor under anoxia by means of EdU staining. (D) Detecting the

圖 1 HIF-1α在低氧誘導(dǎo)的 miR-23a 表達(dá)水平上調(diào)中的作用Fig.1 Role of HIF-1α in anoxia-induced upregulation of miR-23a expression.Note：(A) HIF-1α mediated upregulation of miR-23a under anoxia, *P<0.05.(B) EDHB could upregulate the expression of miR-23a in PASMCs undernormoxia, *P<0.05. (C) HIF-1α mediated the upregulation of the expressionof pri-miR-23a-1 and pri-miR-23a-3 under anoxia, *P<0.05. PASMCs,pulmonary artery smooth muscle cells.

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