【摘要】：目的:本研究旨在構建攜帶脂聯(lián)素(APN)基因的慢病毒,并轉染分離培養(yǎng)的骨髓間充質干細胞(Bone marrow stem cells,BMSCs)體系,同時建立糖尿病大鼠模型,通過尾靜脈輸注移植APN基因修飾的BMSCs,研究APN基因修飾的BMSCs(BMSCs+APN)在改善糖尿病心肌病大鼠心肌損傷與修復中的作用及其潛在機制,也為臨床上治療糖尿病心臟病的并發(fā)癥提供新的治療靶點和實驗依據(jù)。方法:第一部分:從含有目的基因APN的質�？寺∧０逯�,利用PCR技術獲取目的基因片段,將目的基因載體LV5進行雙酶切。將純化的PCR產(chǎn)物與線性化的載體連接,重組產(chǎn)物轉化感受態(tài)細胞,挑取平板上的單克隆先進行雙酶切鑒定,證明目的基因已經(jīng)定向連入LV5載體。再對陽性克隆進行測序和序列比對,比對正確的即為構建成功的目的基因表達質粒載體,將構建好的慢病毒質粒載體進行超純去內毒素抽提。與病毒包裝輔助質粒共感染293T細胞,收集病毒上清液,通過超速離心法得到高滴度的慢病毒原液,慢病毒原液以MOI值為80感染骨髓間充質干細胞,進行慢病毒轉染效果和目的基因表達檢測。第二部分:分離培養(yǎng)2-3周雄性SD大鼠的骨髓間充質干細胞,P2-P3代轉染包裝好的慢病毒。120g左右的雄性SD大鼠70只,隨機選取10只作為正常對照組,其余的60只SD大鼠饑餓,飲水自由24 h后,進行鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)按65mg/kg單次劑量腹腔注射,在STZ注射后的3、5和7d測定大鼠的空腹血糖,血糖≥13.3 mmol/L的大鼠用于糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy,DCM)大鼠模型,DM(Diabetes Mellitus)大鼠隨機分為6組,每組10只,正常組、DM 組、DM+BMSCs 組、DM+BMSCs+Vehicle 組、DM+BMSCs+APN+組、DM+BMSCs+APN-組,通過尾靜脈注射慢病毒轉染的骨髓間充質干細后,每周檢測各組大鼠體重、血糖指標,移植6周后,心肌組織行HE染色,免疫組化法檢測心肌組織膠原Ⅰ和Ⅲ的表達水平。結果:(1)單克隆測序分析證實基因測序結果與APN序列一致,慢病毒感染骨髓間充質干細胞,熒光檢測轉染效率大于80%,Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)在27 KD附近處有目的蛋白特征條帶;(2)DM大鼠模型具有明顯的高血糖癥狀,心臟纖維化程度較重,心臟組織結構異常且心功能受損。APN修飾的BMSCs的輸注可有效減輕DM大鼠的心肌損傷,減輕心臟纖維化程度,改善心臟結構。結論:APN修飾的BMSCs移植到DM大鼠后,可以顯著緩解糖尿病大鼠的心肌損傷,改善心肌纖維化,從而改善糖尿病大鼠心臟功能。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R587.2;R542.2
【圖文】：

浙江大學碩士學位論文邐第三章實驗結果逡逑３．２慢病毒感染性滴度檢測逡逑將慢病毒原液（１０－２０ｕｌ），用含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培液十倍稀釋３－５個梯度逡逑轉染２９３Ｔ細胞，轉染２４邋ｈ吸棄病毒，正常培養(yǎng)７２邋ｈ后觀察拍照，根據(jù)不同稀釋逡逑梯度濃度的熒光圖計算構建好的慢病毒滴度，如下圖的熒光圖片中所示，病毒的逡逑滴度＝熒光細胞數(shù)／病毒原液量（ＴＵ／ｍｌ），慢病毒滴度為ｌＸ１０８ＴＵ／ｍｌ。逡逑

４．邋ＢＭＳＣｓ的形態(tài)和慢病毒轉染效果檢測。（Ａ）為ＢＭＳＣｓ光鏡照片，（Ｂ）為逡逑ＧＦＰ對照慢病毒的ＢＭＳＣｓ，Ｂ為轉染過表徸ＡＰＮ病毒的ＢＭＳＣｓ，（Ｃ）為轉逡逑ＦＰ對照慢病毒的ＢＭＳＣｓ邋，邋（Ｄ）為轉染抑制ＡＰＮ表徸的慢病毒的ＢＭＳＣｓ，逡逑）為Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測ＡＰＮ的表達水平。逡逑４．邋Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ＢＭＳＣｓ邋ａｎｄ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ邋ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ邋（Ａ）邋Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ逡逑ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃｕｌｔｕｒｅｄ邋ＢＭＳＣｓ邋（Ｌｉｇｈｔ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）．邋（Ｂ）邋ＧＦＰ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｉｎ邋ＢＭＳＣｓ逡逑邋ａｆｔｅｒ邋ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｅｍｐｔｙ邋ｖｅｃｔｏｒ邋ｉｎｔｏ邋ＢＭＳＣｓ．邋（Ｃ）邋ＧＦＰ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｉｎ邋ＢＭＳＣｓ邋４８逡逑ｔｅｒ邋ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＡＰＮ邋ｉｎｔｏ邋ＢＭＳＣｓ．邋（Ｄ）邋ＧＦＰ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｉｎ邋ＢＭＳＣｓ邋４８邋ｈ邋ａｆｔｅｒ逡逑ｓｄｕｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＡＰＮ－ｓｈＲＮＡ邋ｉｎｔｏ邋ＢＭＳＣｓ．邋（Ｅ）Ｗｅｓｔｅｍ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＡＰＮ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑ｅｓｓｉｏｎ．逡逑２８逡逑

圖６．各組大鼠心臟組織的ＨＥ染色。（Ａ）Ｃｏｎｔｒｏｌ組大鼠的心臟組織（４００倍）；（Ｂ）ＤＭ逡逑姐人鼠的心臟組織（４００倍）；（Ｃ）ＤＭ＋ＢＭＳＣｓ組大鼠的心臟組織（４００倍）；逡逑（Ｄ）ＤＭ＋ＢＭＳＣｓ＋Ｖｅｈｉｃｌｅ邋組大鼠的心臟組織（４００邋倍）；（Ｅ）邋ＤＭ＋ＢＭＳＣＳ＋ＡＰＮ＋組大逡逑鼠的心臟組織（４００倍）；（Ｆ）邋ＤＭ＋ＢＭＳＣｓ＋ＡＰＮ－組大鼠的心臟組織（４００倍）逡逑Ｆｉｇ邋６．邋Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ邋ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｓ邋ｏｆ邋ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ｓｅｃｔｉｏｎｓ邋ｓｔａｉｎｅｄ邋ｗｉｔｈ逡逑Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ邋ａｎｄ邋Ｅｏｓｉｎ．邋（Ａ）邋ＨＥ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ｈｅａｒｔ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ邋ｒａｔｓ邋（４００逡逑Ｘ）；邋（Ｂ）邋ＨＥ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ｈｅａｒｔ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ＤＭ邋ｇｒｏｕｐ邋ｒａｔｓ邋（４００邋Ｘ）；邋（Ｃ）邋ＨＥ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ逡逑ｈｅａｒｔ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ＤＭ＋ＢＭＳＣｓ邋ｇｒｏｕｐ邋ｒａｔｓ邋（４００邋ｘ）；邋（Ｄ）邋ＨＥ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ｈｅａｒｔ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ｉｎ邋ｔｈｅ逡逑ＤＭ＋ＢＭＳＣｓ＋Ｖｅｈｉｃｌｅ邋ｇｒｏｕｐ邋ｒａｔｓ邋（４０0ｘ）；邋（Ｅ）邋ＨＥ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ｈｅａｒｔ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ｉｎ邋ｔｈｅ逡逑ＤＭ＋ＢＭＳＣｓ＋ＡＰＮ＋ｇｒｏｕｐ邋ｒａｔｓ邋（４０0ｘ）；邋（Ｆ）邋ＨＥ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ｈｅａｒｔ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｔｈｅ逡逑ＤＭ＋ＢＭＳＣｓ＋ＡＰＮ－ｇｒｏｕｐ邋ｒａｔｓ邋（４０0ｘ）．逡逑３．６邋ＡＰＮ修飾的ＢＭＳＣ

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