【摘要】：目的前期工作已證實,骨髓增生異常綜合征(MDS)患者的骨髓造血干細胞上高表達TIM-3,TIM3+干細胞具有高增殖、低分化、低凋亡的特點。本研究從細胞形態(tài)學、細胞遺傳學及動物模型等方面進一步探討TIM3+干細胞的惡性生物學特征,為早期識別MDS惡性克隆提供理論依據(jù)。方法研究對象為天津醫(yī)科大學總醫(yī)院自2016年7月至2018年2月收治的新診斷的MDS患者44例及正常對照者17例。第一部分采用流式細胞術(shù)分選10例MDS初治患者骨髓中TIM3+干細胞(TIM3+CD34+CD38-Lin-細胞群)和TIM3-干細胞(TIM3-CD34+CD38-Lin-細胞群)及4例正常對照者骨髓中CD34+干細胞(CD34+CD38-Lin-細胞群),分別進行瑞氏染色、集落形成單位培養(yǎng)和熒光原位雜交技術(shù)(FISH)檢測,了解TIM3+干細胞的生物學特性。第二部分流式檢測15例MDS患者及8例正常對照骨髓中髓源性抑制細胞(MDSC,CD33+Lin-HLADR-細胞群)上Gal-9的表達情況。流式分選8例MDS初治患者骨髓TIM3+干細胞、TIM3-干細胞和MDSC,分別加入TIM-3抑制劑和Gal-9抑制劑體外混合分組培養(yǎng),檢測TIM3+干細胞和TIM3-干細胞的凋亡情況,分析TIM-3/Gal-9通路在MDS患者TIM3+干細胞與MDSC間的作用。第三部分流式分選11例MDS初治患者骨髓的TIM3+干細胞、TIM3-干細胞和MDSC和5例正常對照者骨髓中CD34+干細胞,移植到32只NCG小鼠體內(nèi),10-12周后采集小鼠外周血和骨髓,流式檢測人源性細胞分化情況,探索TIM3+干細胞在MDS的發(fā)病過程中作用。結(jié)果第一部分分選后的TIM3+干細胞和TIM3-干細胞的純度均在90%以上。MDS患者TIM3+干細胞和TIM3-干細胞甩片后瑞氏染色高倍鏡下觀察細胞均呈圓形或橢圓形、細胞體積較小、胞核大、核仁明顯、核染色質(zhì)細致、胞漿呈淺藍色不帶顆粒、高核漿比,在形態(tài)上呈現(xiàn)為原始幼稚細胞樣。集落形成單位(CFU)檢測,觀察到TIM3+干細胞、TIM3-干細胞和正常骨髓CD34+干細胞形成BFU-E數(shù)量平均值為(6 vs 11 vs 12)個、CFU-E數(shù)量平均值為(3 vs 6 vs 9)個、CFU-GM數(shù)量平均值為(5 vs 17 vs 23)個。同時觀察到TIM3+干細胞形成的單個集落所包含的細胞數(shù)量也較TIM3-干細胞和正常骨髓CD34+干細胞少,且TIM3+干細胞部分細胞未形成集落。FISH檢測染色體核型異常(-7)在一例MDS患者的TIM3+干細胞比例要高于TIM3-干細胞及常規(guī)骨髓細胞(30%vs20%vs 16%);異常核型(+8)在另一例MDS患者的TIM3+干細胞檢測到的比例高于常規(guī)骨髓細胞,而在TIM3-干細胞中未能檢出(5%vs 3%vs 0);異常核型(20q-)在TIM3+干細胞中可以檢測出,常規(guī)骨髓細胞和TIM3-干細胞中均未檢測出該異常核型(26.7%vs 0 vs 0);在正常對照者骨髓CD34+干細胞中均未檢測到異常核型。第二部分我們前期工作已發(fā)現(xiàn)MDS患者骨髓MDSC數(shù)量增多、功能增強,并隨著疾病危險程度增加和疾病進展而上升。MDS組的骨髓MDSC上Gal-9表達率明顯高于正常對照組(0.62±0.64%vs 0.22±0.18%,P0.05)。經(jīng)流式分選后的MDS患者骨髓中MDSC的純度在90%以上。未使用抑制劑的TIM3+干細胞和MDSC混合培養(yǎng)組TIM3+干細胞凋亡比例明顯低于聯(lián)合使用Gal-9和TIM-3兩種抑制劑組及TIM3-干細胞和MDSC混合培養(yǎng)組[12.59(5.12,31.24)vs 42.54(29.41,58.39),65.86(24.44,99.43),P0.05]。第三部分移植TIM3+干細胞和MDSC混合組hCD45表達率明顯高于TIM3+干細胞組、TIM3-干細胞組及正常對照CD34+干細胞組(4.99±5.47%vs 0.65±0.22%,1.68±2.38%,0.55±0.40%,P0.05)。移植TIM3+干細胞組hCD19表達率明顯低于TIM3-干細胞組和正常對照CD34+干細胞組(8.68±9.34%vs27.46±18.06%,37.38±16.14%,P0.01);移植TIM3+干細胞和MDSC混合組hCD19表達率明顯低于TIM3-干細胞組及正常對照CD34+干細胞組(4.76±4.78%vs 27.46±18.06%,37.38±16.14%,P0.05)。移植TIM3+干細胞組hCD33表達率明顯低于TIM3-干細胞組(11.34±14.70%vs 22.45±8.73%,P0.05),低于正常對照CD34+干細胞組(18.03±10.05)%,差異無統(tǒng)計學意義;移植TIM3+干細胞和MDSC混合組hCD33表達率明顯低于TIM3-干細胞組(5.07±5.29%vs 22.45±8.73%,P0.05),低于正常對照CD34+干細胞組,差異無統(tǒng)計學意義。移植TIM3+干細胞組、TIM3-干細胞組、TIM3+干細胞和MDSC混合組及正常對照CD34+干細胞組hCD13表達率分別為(18.50±22.54)%、(6.11±5.26)%、(1.13±0.62)%及(14.33±0.69)%,各組間差異無統(tǒng)計學意義(F=1.101,P=0.367)。移植TIM3+干細胞組、TIM3-干細胞組、TIM3+干細胞和MDSC混合細胞組hCD11b表達率分別為(1.02±1.44)%、(10.19±6.30)%和(8.07±3.70)%。結(jié)論(1)MDS患者的TIM3+干細胞與TIM3-干細胞從形態(tài)學上很難區(qū)分,但兩者集落形成能力有明顯區(qū)別,TIM3+干細胞中更早和更易發(fā)現(xiàn)染色體核型異常,故為不同類型的干細胞,TIM3+干細胞可能為較早發(fā)生核型異常的“惡性”干細胞。(2)MDS患者骨髓MDSC細胞膜上Gal-9的表達明顯增高。TIM3+干細胞和MDSC混合培養(yǎng)組TIM3+干細胞凋亡比例明顯低于TIM3-干細胞和MDSC混合培養(yǎng)組TIM3-干細胞凋亡比例,阻斷TIM-3/Gal-9通路組TIM3+干細胞凋亡比例增高。阻斷TIM-3/Gal-9通路可以抑制MDSC對TIM3+干細胞抗凋亡作用,為清除MDS患者惡性克隆提供新的試驗靶點。(3)TIM3+干細胞和MDSC混合移植到NCG小鼠后,可檢測到人源性細胞數(shù)量最多,在小鼠模型中MDSC可以促進TIM3+干細胞擴增。移植TIM3+干細胞組和TIM3+干細胞與MDSC混合組的人源性細胞,不能像移植TIM3-干細胞或正常對照CD34+干細胞一樣進行正常的分化。推測TIM3+干細胞具有克隆性生長可能,而MDSC對其有促進作用。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R551.3
【圖文】：

天津醫(yī)科大學博士學位論文 一、MDS 患者 TIM3+干細胞生物學特性的研究1.2.2 瑞氏染色顯微鏡下形態(tài)將分選出 MDS 患者（Pt1、Pt2）TIM3+干細胞和 TIM3-干細胞分別甩片后進行瑞氏染色，高倍鏡下觀察細胞形態(tài)。鏡下可見兩種細胞均呈圓形或橢圓形細胞體積較小，胞核大，核仁明顯，核染色質(zhì)細致，胞漿呈淺藍色不帶顆粒，高核漿比，在形態(tài)上呈現(xiàn)為原始幼稚細胞樣（圖 1.3）。因此很難用形態(tài)學識別TIM3+干細胞和 TIM3-干細胞。A B

醫(yī)科大學博士學位論文 一、MDS 患者 TIM3+干細胞生物學特性的研F G1.4 （A）Pt4 骨髓 TIM3+干細胞集落培養(yǎng)培養(yǎng)皿情況，培養(yǎng)皿中罕有紅色；（B）Pt4 骨髓 TIM3+干細胞部分細胞未形成集落；（C）Pt4 骨髓 TIM3+ BFU-E（100×）；（D）Pt4 骨髓 TIM3+干細胞 CFU-GM（100×） ；（E 骨髓 TIM3- 干細胞集落培養(yǎng)培養(yǎng)皿情況，培養(yǎng)皿可見散布紅色集落；（F 骨髓 TIM3- 干細胞 BFU-E（100×）；（G）Pt4 骨髓 TIM3- 干細胞 CFU-G（100×）。

圖 1.4 （A）Pt4 骨髓 TIM3+干細胞集落培養(yǎng)培養(yǎng)皿情落；（B）Pt4 骨髓 TIM3+干細胞部分細胞未形成集落細胞 BFU-E（100×）；（D）Pt4 骨髓 TIM3+干細胞 CPt4 骨髓 TIM3- 干細胞集落培養(yǎng)培養(yǎng)皿情況，培養(yǎng)皿可Pt4 骨髓 TIM3- 干細胞 BFU-E（100×）；（G）Pt4 骨髓（100×）。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號：2792030