【摘要】：一、香煙煙霧暴露大鼠肺小血管中轉(zhuǎn)錄因子KLF4的表達(dá)變化及其與肺血管重塑的關(guān)系目的:觀察香煙煙霧暴露大鼠肺小血管中轉(zhuǎn)錄因子KLF4的表達(dá)變化,研究其與肺血管重塑的關(guān)系。方法:將20只大鼠隨機(jī)分為兩組:對(duì)照組(n= 9)和暴露于香煙煙霧組(n= 11)。所有的動(dòng)物都在第120天取材。以HE染色及中膜厚度計(jì)算觀察和評(píng)估肺血管重塑水平,以平滑肌細(xì)胞α肌動(dòng)蛋白(α-SMA)染色分析肺小血管的肌化程度,以免疫熒光法測(cè)定肺血管KLF4表達(dá)水平,以肺動(dòng)脈平滑肌中增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)評(píng)估肺血管的增殖狀況。結(jié)果:與健康對(duì)照組相比,熏煙組大鼠的一般狀況較差,它們的肺小動(dòng)脈血管壁顯著增厚,肺動(dòng)脈中膜厚度明顯增加,肺血管總的肌化率也顯著增多。與健康對(duì)照組相比,熏煙組大鼠的肺血管中未肌化的血管比例有所降低,而部分肌化及完全肌化的血管的百分比均明顯升高。熏煙模型大鼠肺血管中KLF4的表達(dá)和PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均比健康對(duì)照組顯著增多。結(jié)論:KLF4在香煙煙霧導(dǎo)致的發(fā)生肺血管重塑的血管中表達(dá)增多。PCNA在模型組動(dòng)物血管平滑肌中的表達(dá)顯著增加,提示KLF4可能通過(guò)影響血管平滑肌細(xì)胞的增殖參與香煙煙霧暴露引起的肺血管重塑。二、香煙煙霧提取物致人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖、遷移能力增強(qiáng)的過(guò)程中KLF4的表達(dá)變化及其發(fā)揮的作用目的:探討在香煙煙霧提取物(CSE)作用的情況下,KLF4是否調(diào)控了人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HPASMCs)的增殖和遷移,以及其與AKT信號(hào)通路的關(guān)系。方法:以不同濃度的CSE干預(yù)HPASMCs48小時(shí),用CCK-8實(shí)驗(yàn)觀察HPASMCs的細(xì)胞活性,進(jìn)而選出促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖的最佳濃度。以此最佳濃度的CSE按不同作用時(shí)間刺激平滑肌細(xì)胞后用Western blot法檢測(cè)KLF4蛋白的表達(dá)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)選出理想的KLF4-siRNA序列,然后將細(xì)胞分成4組:對(duì)照組(NC-si組)、KLF4沉默組(KLF4-si 組)、CSE 刺激組(CSE+ NC-si 組),CSE 刺激 + KLF4 沉默組(CSE+ KLF4-si組)。通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞活力檢測(cè)及PCNA蛋白的表達(dá)測(cè)定觀察比較細(xì)胞的增殖情況,通過(guò)Transwell遷移實(shí)驗(yàn)比較細(xì)胞的遷移能力。通過(guò)檢測(cè)AKT和磷酸化AKT的蛋白水平的表達(dá)變化,探討KLF4是否通過(guò)此信號(hào)通路影響了肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移。結(jié)果:2%CSE持續(xù)作用48小時(shí)對(duì)HPASMCs的促增殖作用最強(qiáng),于此同時(shí)在2%CSE刺激下KLF4的蛋白表達(dá)水平升高。在2%CSE刺激的條件下,HPASMCs的細(xì)胞數(shù)量增多,PCNA的表達(dá)水平、細(xì)胞活力及細(xì)胞遷移能力也明顯增強(qiáng),而KLF4-siRNA可以明顯抑制因CSE引起的上述改變。另外,CSE誘導(dǎo)引起的AKT磷酸化水平的上升在KLF4沉默組細(xì)胞中也得到了顯著的抑制。結(jié)論:KLF4可能通過(guò)作用于AKT信號(hào)通路促進(jìn)了 CSE介導(dǎo)的HPASMCs的增殖與遷移。三、經(jīng)氣道注入AAV1-KLF4-shRNA構(gòu)建肺血管基因敲減模型,并觀察其在香煙煙霧所致肺動(dòng)脈高壓中的預(yù)防作用目的:在香煙煙霧暴露致大鼠肺動(dòng)脈高壓模型中觀察經(jīng)氣道注入1型腺相關(guān)病毒(AAV1)攜帶的KLF4-shRNA是否對(duì)肺血管有持續(xù)的KLF4基因敲減作用,并觀察這種選擇性的基因敲減是否能預(yù)防肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生發(fā)展。方法:動(dòng)物隨機(jī)分為健康對(duì)照組、預(yù)防干預(yù)組(AAV1-KLF4-shRNA)、對(duì)照病毒模型組(AAV1-controlvector)和生理鹽水模型組。后三組大鼠氣管內(nèi)給藥30天后,接受香煙煙霧刺激4個(gè)月。我們用右心導(dǎo)管進(jìn)行血流動(dòng)力學(xué)測(cè)量,計(jì)算右心室肥厚指數(shù),觀察肺血管重塑和肌化程度,并通過(guò)免疫組化染色比較各組大鼠肺動(dòng)脈中KLF4和PCNA的表達(dá)變化。結(jié)果:在兩組肺動(dòng)脈高壓模型組(生理鹽水模型組和對(duì)照病毒模型組),部分血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)(右心室收縮壓、右心室平均壓、右心室收縮指數(shù)、dp/dt max等)、反映肺血管和右心室重塑的指標(biāo)(肺小動(dòng)脈中膜厚度、右心室肥厚指數(shù)和右室重/體重等)、肺血管肌化率、肺動(dòng)脈中KLF4和PCNA的表達(dá)均比健康對(duì)照組顯著升高。而在預(yù)防干預(yù)組,上述指標(biāo)均比兩組模型組顯著減少。結(jié)論:通過(guò)1型腺相關(guān)病毒(AAV1)攜帶的KLF4-shRNA靶向血管敲減KLF4基因可以有效預(yù)防肺動(dòng)脈高壓的發(fā)展。四、經(jīng)氣道注入AAV1-KLF4-shRNA在香煙煙霧所致肺動(dòng)脈高壓中的治療作用目的:探討經(jīng)氣道注入1型腺相關(guān)病毒(AAV1)攜帶的KLF4-shRNA是否對(duì)肺動(dòng)脈高壓有治療效果。方法:先將大鼠隨機(jī)分為兩組:健康對(duì)照組和吸煙組。吸煙組每日2次暴露于香煙煙霧,對(duì)照組暴露于空氣中。3個(gè)月后,將吸煙組大鼠再隨機(jī)分為3組:氣管內(nèi)注入AAV1攜帶的KLF4shRNA(治療組)、AAV1攜帶的對(duì)照載體(AAVl-controlvector)組、生理鹽水組。繼續(xù)按原方案熏煙1個(gè)月后,對(duì)4組大鼠進(jìn)行血流動(dòng)力學(xué)測(cè)量,并計(jì)算右心室肥厚指數(shù),觀察肺血管重塑和肌化程度。通過(guò)免疫組化染色測(cè)定肺動(dòng)脈KLF4和PCNA水平。結(jié)果:在兩組肺動(dòng)脈高壓模型組(生理鹽水模型組和對(duì)照病毒模型組),部分血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)(右心室收縮壓、右心室平均壓、右心室收縮指數(shù)、dp/dtmax等)、反映肺血管和右心室重塑的指標(biāo)(肺小動(dòng)脈中膜厚度、右心室肥厚指數(shù)和右室重/體重等)、肺血管肌化率、肺動(dòng)脈中KLF4和PCNA的表達(dá)均比健康對(duì)照組顯著升高。而在治療干預(yù)組,上述指標(biāo)均比兩組模型組顯著減少。結(jié)論:轉(zhuǎn)錄因子KLF4的上調(diào)在與肺動(dòng)脈高壓相關(guān)的血管及右心室的病理改變中起了重要作用,選擇性肺血管KLF4基因敲減可以作為肺動(dòng)脈高壓的治療的新手段。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R544.1
【圖文】：

圖 1 肺血管重塑的觀察比較 肺血管 HE 染色圖像 A 健康對(duì)照組（Control）B 吸煙組（Smoke），標(biāo)尺：50μm；C：兩組大鼠肺小動(dòng)脈血管的中膜厚度比較，n= 8，*P < 0.05。3.3 大鼠肺血管肌化程度比較如圖 2 所示，吸煙組大鼠的肺血管肌化程度明顯高于健康對(duì)照組。其中，對(duì)照組大鼠肺血管總的肌化率為 14 3%，而吸煙組大鼠肺血管總的肌化率為 49 6%（P <0.001）；另外，與健康對(duì)照組相比，吸煙組大鼠的肺血管中未肌化的血管比例有所降低（P < 0.001），而部分肌化及完全肌化的血管的百分比均明顯升高（部分肌化 P <0.01；完全肌化 P < 0.001）（圖 2）。3.4 模型組大鼠肺血管中 KLF4 表達(dá)升高免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，吸煙組大鼠肺血管中 KLF4 的表達(dá)明顯強(qiáng)于健康對(duì)照組（圖

圖 2 大鼠肺血管肌化程度比較 A 健康對(duì)照組（Control）和 B 吸煙組（Smoke）的 α-SMA 免疫組化的代表圖像，標(biāo)尺：100μm；C 和 D 是上述兩組的局部肺小血管的放大圖像；E 為兩組大鼠肺小血管總肌化率的比較，F(xiàn) 比較兩組大鼠肺小血管中未肌化血管（NM）、部分肌化血管（PM）和完全肌化血管（M）占所有肺小血管的百分比 n= 8，**P < 0.01，***P < 0.001。

吸煙組大鼠肺血管中 KLF4 的表達(dá)明顯強(qiáng)于健康對(duì)照組（圖3A）。經(jīng)測(cè)算兩組肺血管中陽(yáng)性區(qū)域的平均積分光密度(IOD)，吸煙組明顯高于健康對(duì)照組，約為對(duì)照組的 4 倍（P < 0.05）（圖 3B）。3.5 模型組大鼠肺血管平滑肌中 PCNA 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多關(guān)于增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示，模型組大鼠肺血管中 PCNA陽(yáng)性平滑肌細(xì)胞數(shù)顯著增多（圖 4A-B）。計(jì)算各組 PCNA 陽(yáng)性細(xì)胞核與總細(xì)胞核的比

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2790633