【摘要】：一、香煙煙霧暴露大鼠肺小血管中轉錄因子KLF4的表達變化及其與肺血管重塑的關系目的:觀察香煙煙霧暴露大鼠肺小血管中轉錄因子KLF4的表達變化,研究其與肺血管重塑的關系。方法:將20只大鼠隨機分為兩組:對照組(n= 9)和暴露于香煙煙霧組(n= 11)。所有的動物都在第120天取材。以HE染色及中膜厚度計算觀察和評估肺血管重塑水平,以平滑肌細胞α肌動蛋白(α-SMA)染色分析肺小血管的肌化程度,以免疫熒光法測定肺血管KLF4表達水平,以肺動脈平滑肌中增殖細胞核抗原(PCNA)評估肺血管的增殖狀況。結果:與健康對照組相比,熏煙組大鼠的一般狀況較差,它們的肺小動脈血管壁顯著增厚,肺動脈中膜厚度明顯增加,肺血管總的肌化率也顯著增多。與健康對照組相比,熏煙組大鼠的肺血管中未肌化的血管比例有所降低,而部分肌化及完全肌化的血管的百分比均明顯升高。熏煙模型大鼠肺血管中KLF4的表達和PCNA陽性細胞數(shù)均比健康對照組顯著增多。結論:KLF4在香煙煙霧導致的發(fā)生肺血管重塑的血管中表達增多。PCNA在模型組動物血管平滑肌中的表達顯著增加,提示KLF4可能通過影響血管平滑肌細胞的增殖參與香煙煙霧暴露引起的肺血管重塑。二、香煙煙霧提取物致人肺動脈平滑肌細胞增殖、遷移能力增強的過程中KLF4的表達變化及其發(fā)揮的作用目的:探討在香煙煙霧提取物(CSE)作用的情況下,KLF4是否調控了人肺動脈平滑肌細胞(HPASMCs)的增殖和遷移,以及其與AKT信號通路的關系。方法:以不同濃度的CSE干預HPASMCs48小時,用CCK-8實驗觀察HPASMCs的細胞活性,進而選出促進平滑肌細胞增殖的最佳濃度。以此最佳濃度的CSE按不同作用時間刺激平滑肌細胞后用Western blot法檢測KLF4蛋白的表達。通過實驗選出理想的KLF4-siRNA序列,然后將細胞分成4組:對照組(NC-si組)、KLF4沉默組(KLF4-si 組)、CSE 刺激組(CSE+ NC-si 組),CSE 刺激 + KLF4 沉默組(CSE+ KLF4-si組)。通過細胞計數(shù)和細胞活力檢測及PCNA蛋白的表達測定觀察比較細胞的增殖情況,通過Transwell遷移實驗比較細胞的遷移能力。通過檢測AKT和磷酸化AKT的蛋白水平的表達變化,探討KLF4是否通過此信號通路影響了肺動脈平滑肌細胞的增殖、遷移。結果:2%CSE持續(xù)作用48小時對HPASMCs的促增殖作用最強,于此同時在2%CSE刺激下KLF4的蛋白表達水平升高。在2%CSE刺激的條件下,HPASMCs的細胞數(shù)量增多,PCNA的表達水平、細胞活力及細胞遷移能力也明顯增強,而KLF4-siRNA可以明顯抑制因CSE引起的上述改變。另外,CSE誘導引起的AKT磷酸化水平的上升在KLF4沉默組細胞中也得到了顯著的抑制。結論:KLF4可能通過作用于AKT信號通路促進了 CSE介導的HPASMCs的增殖與遷移。三、經(jīng)氣道注入AAV1-KLF4-shRNA構建肺血管基因敲減模型,并觀察其在香煙煙霧所致肺動脈高壓中的預防作用目的:在香煙煙霧暴露致大鼠肺動脈高壓模型中觀察經(jīng)氣道注入1型腺相關病毒(AAV1)攜帶的KLF4-shRNA是否對肺血管有持續(xù)的KLF4基因敲減作用,并觀察這種選擇性的基因敲減是否能預防肺動脈高壓的發(fā)生發(fā)展。方法:動物隨機分為健康對照組、預防干預組(AAV1-KLF4-shRNA)、對照病毒模型組(AAV1-controlvector)和生理鹽水模型組。后三組大鼠氣管內給藥30天后,接受香煙煙霧刺激4個月。我們用右心導管進行血流動力學測量,計算右心室肥厚指數(shù),觀察肺血管重塑和肌化程度,并通過免疫組化染色比較各組大鼠肺動脈中KLF4和PCNA的表達變化。結果:在兩組肺動脈高壓模型組(生理鹽水模型組和對照病毒模型組),部分血流動力學指標(右心室收縮壓、右心室平均壓、右心室收縮指數(shù)、dp/dt max等)、反映肺血管和右心室重塑的指標(肺小動脈中膜厚度、右心室肥厚指數(shù)和右室重/體重等)、肺血管肌化率、肺動脈中KLF4和PCNA的表達均比健康對照組顯著升高。而在預防干預組,上述指標均比兩組模型組顯著減少。結論:通過1型腺相關病毒(AAV1)攜帶的KLF4-shRNA靶向血管敲減KLF4基因可以有效預防肺動脈高壓的發(fā)展。四、經(jīng)氣道注入AAV1-KLF4-shRNA在香煙煙霧所致肺動脈高壓中的治療作用目的:探討經(jīng)氣道注入1型腺相關病毒(AAV1)攜帶的KLF4-shRNA是否對肺動脈高壓有治療效果。方法:先將大鼠隨機分為兩組:健康對照組和吸煙組。吸煙組每日2次暴露于香煙煙霧,對照組暴露于空氣中。3個月后,將吸煙組大鼠再隨機分為3組:氣管內注入AAV1攜帶的KLF4shRNA(治療組)、AAV1攜帶的對照載體(AAVl-controlvector)組、生理鹽水組。繼續(xù)按原方案熏煙1個月后,對4組大鼠進行血流動力學測量,并計算右心室肥厚指數(shù),觀察肺血管重塑和肌化程度。通過免疫組化染色測定肺動脈KLF4和PCNA水平。結果:在兩組肺動脈高壓模型組(生理鹽水模型組和對照病毒模型組),部分血流動力學指標(右心室收縮壓、右心室平均壓、右心室收縮指數(shù)、dp/dtmax等)、反映肺血管和右心室重塑的指標(肺小動脈中膜厚度、右心室肥厚指數(shù)和右室重/體重等)、肺血管肌化率、肺動脈中KLF4和PCNA的表達均比健康對照組顯著升高。而在治療干預組,上述指標均比兩組模型組顯著減少。結論:轉錄因子KLF4的上調在與肺動脈高壓相關的血管及右心室的病理改變中起了重要作用,選擇性肺血管KLF4基因敲減可以作為肺動脈高壓的治療的新手段。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R544.1
【圖文】：

圖 1 肺血管重塑的觀察比較 肺血管 HE 染色圖像 A 健康對照組（Control）B 吸煙組（Smoke），標尺：50μm；C：兩組大鼠肺小動脈血管的中膜厚度比較，n= 8，*P < 0.05。3.3 大鼠肺血管肌化程度比較如圖 2 所示，吸煙組大鼠的肺血管肌化程度明顯高于健康對照組。其中，對照組大鼠肺血管總的肌化率為 14 3%，而吸煙組大鼠肺血管總的肌化率為 49 6%（P <0.001）；另外，與健康對照組相比，吸煙組大鼠的肺血管中未肌化的血管比例有所降低（P < 0.001），而部分肌化及完全肌化的血管的百分比均明顯升高（部分肌化 P <0.01；完全肌化 P < 0.001）（圖 2）。3.4 模型組大鼠肺血管中 KLF4 表達升高免疫熒光實驗顯示，吸煙組大鼠肺血管中 KLF4 的表達明顯強于健康對照組（圖

圖 2 大鼠肺血管肌化程度比較 A 健康對照組（Control）和 B 吸煙組（Smoke）的 α-SMA 免疫組化的代表圖像，標尺：100μm；C 和 D 是上述兩組的局部肺小血管的放大圖像；E 為兩組大鼠肺小血管總肌化率的比較，F(xiàn) 比較兩組大鼠肺小血管中未肌化血管（NM）、部分肌化血管（PM）和完全肌化血管（M）占所有肺小血管的百分比 n= 8，**P < 0.01，***P < 0.001。

吸煙組大鼠肺血管中 KLF4 的表達明顯強于健康對照組（圖3A）。經(jīng)測算兩組肺血管中陽性區(qū)域的平均積分光密度(IOD)，吸煙組明顯高于健康對照組，約為對照組的 4 倍（P < 0.05）（圖 3B）。3.5 模型組大鼠肺血管平滑肌中 PCNA 陽性細胞數(shù)增多關于增殖細胞核抗原（PCNA）的免疫組化實驗顯示，模型組大鼠肺血管中 PCNA陽性平滑肌細胞數(shù)顯著增多（圖 4A-B）。計算各組 PCNA 陽性細胞核與總細胞核的比

【參考文獻】

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本文編號：2790633