【摘要】：1研究背景動脈粥樣硬化疾病(atherosclerosis,AS)是一種動脈管壁的進(jìn)展性炎癥疾病,在引起急性心腦血管疾病例如心肌梗死和中風(fēng)之前可以很多年都沒有臨床癥狀。在AS的發(fā)展過程中,伴隨內(nèi)皮細(xì)胞損傷,脂肪和膽固醇逐漸沉積在動脈管壁上,形成AS脂核,在脂核之外,覆蓋著一層由平滑肌細(xì)胞(SMC)、成纖維細(xì)胞和膠原組織等形成的纖維帽。AS斑塊中還有巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞的浸潤。當(dāng)纖維帽中的SMC減少、細(xì)胞外基質(zhì)合成減少或降解增多時,斑塊纖維帽變薄,導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定和斑塊破裂,引發(fā)急性冠脈事件。因此尋找增加斑塊穩(wěn)定性的方法和藥物具有重要的臨床意義。目前,在干細(xì)胞與AS領(lǐng)域的研究表明,間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)可以遷移到損傷組織,分化為功能細(xì)胞并且修復(fù)受損的組織。移植的MSC可以定位到破裂的斑塊區(qū)域,分化成為內(nèi)皮細(xì)胞并分泌膠原纖維。此外,骨髓、血液循環(huán)以及動脈外膜中的平滑肌祖細(xì)胞都可以分化為SMC并遷移到損傷區(qū)域;在某些條件下,外膜中的胚胎成纖維細(xì)胞也可以向內(nèi)膜遷移并分化為SMC。干細(xì)胞抗原1(Stem cell antigen 1,Sca1)是外膜平滑肌祖細(xì)胞的常見標(biāo)志物,由于外膜中的Sca1+血管祖細(xì)胞和胚胎成纖維細(xì)胞更靠近AS的損傷內(nèi)膜并且來源更加廣泛,因此如何有序調(diào)控Sca1細(xì)胞和胚胎成纖維細(xì)胞向SMC的精準(zhǔn)分化變得更加重要。大量研究表明,DKK3對于胚胎組織的生長發(fā)育不可缺少,例如神經(jīng)管上皮、胚芽和骨組織,另外DKK3可以抑制多種類型的細(xì)胞腫瘤,過表達(dá)時可以抑制細(xì)胞的增殖;目前,有研究指出DKK3能夠影響上皮-間充質(zhì)的轉(zhuǎn)化,促進(jìn)部分誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(partially induced pluripotent stem cell)向平滑肌細(xì)胞分化。因此DKK3可能是一種合適的干細(xì)胞誘導(dǎo)因子,深入研究DKK3誘導(dǎo)調(diào)控外膜Sca1+血管祖細(xì)胞和胚胎成纖維細(xì)胞向SMC分化影響斑塊穩(wěn)定性的機(jī)制具有十分重要的臨床意義。2研究目的我們的研究目的包括:(1)研究DKK3對于胚胎成纖維細(xì)胞和Sca1+細(xì)胞誘導(dǎo)分化的促進(jìn)作用及其分子機(jī)制;(2)研究兩種分化而來的SMC對于DKK3-/-ApoE-/-小鼠串聯(lián)狹窄手術(shù)引起的動脈粥樣硬化病變的作用,探討DKK3對于AS斑塊炎癥、平滑肌細(xì)胞數(shù)量以及細(xì)胞外基質(zhì)含量的影響;(3)研究DKK3對于家兔動脈粥樣硬化斑塊的影響;(4)在臨床患者中研究DKK3與動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的關(guān)系。3研究方法1.小鼠串聯(lián)狹窄病變模型將 8 周齡 DKK3-/-/ApoE-/-和 DKK3+/+/ApoE-/-小鼠(C57BL/6J 背景)高脂喂養(yǎng)6周然后進(jìn)行手術(shù)。麻醉后分離右側(cè)頸總動脈,分別在距離頸動脈分叉處1mm的遠(yuǎn)端和距離遠(yuǎn)端狹窄3mm的近端制作一個外徑為150μm的串聯(lián)狹窄。繼續(xù)飼養(yǎng)4周造成動脈粥樣硬化模型。2.血管外膜細(xì)胞孵育將總量為1×106來源于GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的Sca-1+祖細(xì)胞與25μL的Matrigel(?)基底膜混合,然后接種于接受串聯(lián)狹窄手術(shù)小鼠的頸動脈外膜中。4周后取材進(jìn)行后續(xù)實驗。3.DKK3凝膠釋放實驗在DKK3釋放實驗中,將重組的DKK3(200ng/mL)與30%的Pluronic 127凝膠混合,然后外敷于接受串聯(lián)狹窄手術(shù)的小鼠的頸動脈外膜上將血管包住。4周后取材進(jìn)行后續(xù)實驗。4.靜脈移植實驗選取3月齡DKK3-/-/ApoE-/-和DKK3+/+/ApoE-/-小鼠,麻醉后將右側(cè)頸總動脈游離,切去一段動脈,取一段同窩異體小鼠的腔靜脈用8.0絲線與兩個動脈斷端吻合。觀察到移植靜脈有搏動證明移植成功。5.股動脈損傷和細(xì)胞孵育實驗DKK3+/+/APoE-/-小鼠麻醉后分離雙側(cè)股動脈,來回插入0.25mm導(dǎo)絲三次造成動脈損傷,長度為從股動脈到遠(yuǎn)端肌肉分支4mm。右側(cè)損傷股動脈外膜注入25μL的Matrigel?人工基底膜,其中包含源自SM22-Lacz小鼠的Sca-1+細(xì)胞和胚胎成纖維細(xì)胞(1×106),另一端作為對照,72小時后取材。6.體內(nèi)基質(zhì)膠栓實驗在嚴(yán)重免疫缺陷小鼠背部和腰間皮下注射50μL混有HUVECs的基質(zhì)膠,實驗組膠內(nèi)加入標(biāo)記有Qtracker?605的胚胎成纖維細(xì)胞分化的SMC,對照組膠內(nèi)加入未誘導(dǎo)的胚胎成纖維細(xì)胞。每組小鼠各選擇六個注射點。12天后處死小鼠并將栓子取出,一部分迅速投入液氮,進(jìn)行后續(xù)的冰凍切片實驗;另一部分用4%福爾馬林溶液浸泡過夜后進(jìn)行組織學(xué)染色。7.組織學(xué)染色石蠟切片或冰凍切片用HE染色觀察形態(tài),免疫組織化學(xué)染色檢查RAM-11、α-SMA、MMP-9,免疫熒光檢測 SM22、SMMHC、SMA、CD68,Collal、DKK3、elastin、CD31、CD144、Calponin、Sca1,天狼猩紅染色檢查彈力纖維和膠原。8.β-半乳糖苷酶原位染色取5mm經(jīng)過損傷手術(shù)的股動脈,剝?nèi)ブ窘M織和血管外膜后沿長軸縱切,用β-半乳糖苷酶染色固定液固定組織,加入染色工作液,37℃孵育直至部分細(xì)胞顏色變藍(lán)。然后在普通光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。9.細(xì)胞培養(yǎng)人類胚胎成纖維細(xì)胞購自ATCC,用F-12K培養(yǎng)基(ATCC,30-2004)培養(yǎng)。每兩天更換一次培養(yǎng)基,每三天按照1:3或者1:7的比例傳代。小鼠Sca-1+祖細(xì)胞和胚胎成纖維細(xì)胞分離自不同小鼠的主動脈內(nèi)膜,包括ApoE-/-小鼠、野生型小鼠以及轉(zhuǎn)基因小鼠(GFP-Sca-1;SM22-LacZ),然后用抗Sca-1磁珠試劑盒純化細(xì)胞。純化后細(xì)胞用含10%的EmbryoMax?內(nèi)皮細(xì)胞級的高品質(zhì)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)基中加入10ng/ml的白血病抑制因子和0.1mM的2-巰基乙醇,培養(yǎng)皿同樣預(yù)先包被0.4%的明膠。分離Sca-1+細(xì)胞后,剩余細(xì)胞用胚胎成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),傳代5次后即為純化的胚胎成纖維細(xì)胞。10.細(xì)胞轉(zhuǎn)染和藥物刺激人類胚胎成纖維細(xì)胞和Sca1+細(xì)胞加入過表達(dá)腺病毒,24小時后換液,繼續(xù)加入指定藥物刺激,培養(yǎng)至指定時間收取細(xì)胞;人類胚胎成纖維細(xì)胞和Sca1+細(xì)胞加入沉默慢病毒和polybrene,24小時后換液,繼續(xù)加入指定藥物刺激,培養(yǎng)至指定時間收取細(xì)胞。11.胚胎成纖維細(xì)胞核轉(zhuǎn)染ATF6用NHDF核轉(zhuǎn)染試劑盒對人胚胎成纖維細(xì)胞進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)染ATF6轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒,對照組用PCMV5空載體。將2×106個細(xì)胞和2μg的空載體或ATF6質(zhì)粒共培養(yǎng),然后接種于包被明膠的培養(yǎng)板上,在DM培養(yǎng)基中分化48小時,收集細(xì)胞進(jìn)行Q-PCR實驗。12.RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和Q-PCR按照說明書用RNA提取試劑盒提取總RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后進(jìn)行Q-PCR。13.免疫印跡將20-50μg總蛋白與1×的SDS上樣緩沖液煮沸10分鐘,根據(jù)蛋白分子量的不同選擇4%-12%的Bis-Tris膠,然后用90V電壓電泳分離蛋白,200mA電流轉(zhuǎn)膜2小時將膠上蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,然后用TBST配制的5%牛奶室溫下封閉1小時,用相應(yīng)一抗孵育過夜。第二天用相應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育PVDF膜,室溫下孵育2小時,然后用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白。14.細(xì)胞免疫熒光細(xì)胞首先用4%多聚甲醛固定,然后在室溫下用5%豬血清封閉30分鐘。用相應(yīng)一抗孵育過夜。第二天用相應(yīng)的熒光二抗37℃下孵育30分鐘,用DAPI染核,用熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡觀察。15.酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)血清或培養(yǎng)基按照說明書進(jìn)行稀釋后按照步驟進(jìn)行操作,檢測血清和培養(yǎng)基中DKK3濃度,培養(yǎng)基中的膠原1a1和TGFβ1的濃度。16.熒光素酶活性分析在進(jìn)行胚胎成纖維細(xì)胞實驗時,預(yù)先在12孔板中包被明膠,轉(zhuǎn)染DKK3過表達(dá)病毒,24小時后用myocardin或SMMHC啟動子報告載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞,對照組加入pGL3-Luc-Renilla。轉(zhuǎn)染48小時后用多功能酶標(biāo)儀檢測熒光素酶和光素酶活性。相對熒光素酶單位(Relative Luciferase Unit,RLU)定義為熒光素酶與光素酶的比值,空白對照組設(shè)置為1.0。17.家兔實驗20只體重在1.5-2.0 kg,年齡在8-10周的新西蘭大白兔隨機(jī)分為2組,每組10只。首先耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉家兔,利多卡因局部麻醉后暴露右側(cè)股動脈,用小剪刀剪一個小口,插入針鞘,將導(dǎo)絲從針鞘插入直到胸主動脈,取一個4-Fr球囊導(dǎo)管(3.5×15 mm2)沿導(dǎo)絲進(jìn)入股動脈,進(jìn)入足夠深度后用肝素鹽水充盈球囊,加壓至8個大氣壓力,然后將球囊導(dǎo)管回抽至腹主動脈分叉處,釋放球囊內(nèi)壓力并再次插入到胸主動脈處,反復(fù)進(jìn)入回抽三次造成動脈內(nèi)膜損傷。術(shù)后家兔繼續(xù)用含1%膽固醇和3%豬油的飼料喂養(yǎng)12周。從第12周開始,每兩周通過耳緣靜脈注射一次腺病毒,病毒量為2.5×109pfu,實驗組注射DKK3過表達(dá)病毒,對照組注射相同量的腺病毒空載體,從第13周開始,每兩周耳中動脈取血一次,第20周處死家兔,取整段主動脈進(jìn)行后續(xù)實驗。18.主動脈油紅O染色分離整段主動脈,剝離血管外膜和脂肪組織,縱切,暴露血管內(nèi)膜,拍照后用油紅O染液浸泡2-4小時然后用70%酒精脫色直到僅內(nèi)膜中的脂肪組織著色。然后用蒸餾水沖洗,置于4%福爾馬林溶液中保存。將染色后的整段血管展開后拍照分析。19.血脂檢測小鼠處死時心臟取血0.5-1.0mL,室溫下靜置1小時直至血液凝結(jié),然后以2000 g/min的速度離心15分鐘。家兔造模后分別在第12、13、14、15、17、20周取血,用全自動生化分析儀檢測血清中總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)的含量。20.臨床患者檢測收集山東大學(xué)齊魯醫(yī)院從2015年6月至2015年]2月的病例,根據(jù)患者的病史和臨床癥狀按照Braunwald分類法分為穩(wěn)定性心絞痛組和不穩(wěn)定性心絞痛組。記錄入組患者的一般臨床指標(biāo),包括身高、體重、年齡、性別、血壓、血糖、每日吸煙和飲酒量。入組患者在用藥前進(jìn)行一次靜脈采血,化驗室檢測其血清中白細(xì)胞、肌酐、纖維蛋白原、同型半胱氨酸、空腹血糖、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白,用ELISA試劑盒檢測血清中DKK3含量。4研究結(jié)果1.DKK3敲除改變動脈粥樣硬化斑塊成分利用串聯(lián)狹窄手術(shù)構(gòu)建小鼠動脈粥樣硬化模型,4周后進(jìn)行HE染色可見DKK3-/-ApoE—/-雙敲小鼠斑塊內(nèi)出血多于DKK3+/+ApoE-/-小鼠,而斑塊中SMC含量和細(xì)胞外基質(zhì)含量少于DKK3+/+ApoE-_-小鼠,巨噬細(xì)胞浸潤多于DKK3+/+ApoE-/-小鼠,天狼猩紅染色顯示DKK3-/-ApoE-/-雙敲小鼠彈力纖維和膠原表達(dá)減少。2.DKK敲除增加移植血管破裂發(fā)生率構(gòu)建小鼠頸動脈移植模型,在DKK3-/-ApoE-/-雙敲小鼠組,十只小鼠全部發(fā)生了移植血管破裂并發(fā)癥,可見破裂、壞死、鈣化和紅細(xì)胞聚集,而DKK3+/+ApoE-/-小鼠組僅有2只發(fā)生移植血管破裂并發(fā)癥。檢測斑塊內(nèi)成分發(fā)現(xiàn)DKK3-/-ApoE-/-雙敲小鼠斑塊內(nèi)SMC減少而CD68+巨噬細(xì)胞增多,而彈力纖維和膠原含量減少。3.DKK3促進(jìn)Sca1+細(xì)胞遷移對小鼠進(jìn)行串聯(lián)狹窄手術(shù),取帶有GFP標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因小鼠的原代Sca1+細(xì)胞,注射到手術(shù)后的頸動脈外膜中,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Sca1+細(xì)胞在4周內(nèi)遷移到DKK3+/+ApoE-/-小鼠內(nèi)膜,并部分分化為SMC,而Sca1+細(xì)胞在DKK3-_-ApoE-_-雙敲小鼠血管外膜中的遷移能力降低。此外,Sca1+細(xì)胞減少了 DKK3+/+ApoE-_-小鼠斑塊內(nèi)出血的發(fā)生率。4.Sca1+細(xì)胞和胚胎成纖維細(xì)胞促進(jìn)內(nèi)膜損傷修復(fù)對DKK3+/+ApoE-/-小鼠進(jìn)行股動脈損傷手術(shù),將來自SM22-Lacz小鼠和野生型小鼠的Sca1+細(xì)胞和胚胎成纖維細(xì)胞注射至其血管外膜,3天后可見細(xì)胞遷移至內(nèi)膜并分化為SMC。5.DKK3在體外可以誘導(dǎo)胚胎成纖維細(xì)胞分化為SMCDKK3可以促進(jìn)胚胎成纖維細(xì)胞在DM分化培養(yǎng)基中的分化,4天后形態(tài)上即逐漸向SMC轉(zhuǎn)化,在基因水平和蛋白水平上都表達(dá)SMC的特異分子,并且可見SMMHC和myocadin的啟動子活性明顯增加。6.DKK3誘導(dǎo)胚胎成纖維細(xì)胞向SMC的分化受TGF-β1調(diào)節(jié)在DKK3過表達(dá)和僅有空載體處理的胚胎成纖維細(xì)胞中添加人的重組TGF-β]因子。結(jié)果同時添加DKK3過表達(dá)病毒和TGF-β1重組蛋白的胚胎成纖維細(xì)胞形態(tài)與未處理的胚胎成纖維細(xì)胞和僅添加TGF-β1因子的成纖維細(xì)胞明顯不同,前者形態(tài)更趨向于平滑肌。PCR和免疫印跡顯示TGF-β]刺激可以進(jìn)一步增加過表達(dá)DKK3的胚胎成纖維細(xì)胞表達(dá)SMC特異分子和細(xì)胞外基質(zhì)。在DKK3過表達(dá)的胚胎成纖維細(xì)胞中添加TGF-β1受體ALK5的特異性抑制劑,結(jié)果顯示,ALK5受抑制后,SMC特異蛋白的表達(dá)顯著下降。同樣,向培養(yǎng)基中添加抑制活化TGF-β1的特異性中和抗體也可以抑制SMC標(biāo)志物的表達(dá)。向添加TGF-β1細(xì)胞因子的胚胎成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入含或不含DKK3沉默(shDKK3)的慢病毒。結(jié)果顯示,DKK3沉默后,SMC特異蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)明顯減少。用慢病毒外源性沉默TGF-β1的表達(dá)也可以減少SMC特異蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)的分泌,這表明SMC的分化進(jìn)程受到了抑制。7.DKK3通過激活A(yù)TF6調(diào)節(jié)TGF-β1的表達(dá)通過Qiagen Champion芯片轉(zhuǎn)錄因子搜索發(fā)現(xiàn)當(dāng)DKK3過表達(dá)時轉(zhuǎn)錄激活因子6(ATF6)上調(diào)。為了驗證DKK3是否能夠誘導(dǎo)ATF6的表達(dá),我們對胚胎成纖維細(xì)胞感染了 shDKK3或者空病毒載體,結(jié)果發(fā)現(xiàn)DKK3沉默時,ATF6表達(dá)也下降,同時,用小干擾RNA沉默ATF6也可以導(dǎo)致TGF-β1在基因水平和蛋白水平的減少,相反ATF6過表達(dá)則不僅可以增加TGF-β1的表達(dá)還能增加SMC各種特異蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)。8.DKK3誘導(dǎo)胚胎成纖維細(xì)胞分化為有功能的SMC我們還采用基質(zhì)膠栓注射的實驗來研究誘導(dǎo)的SMC與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)混合時在體內(nèi)形成功能血管的能力。DKK3誘導(dǎo)的SMC添加了紅色追蹤標(biāo)簽然后在人工基底膜中與HUVEC混合,混合后注入重癥綜合性免疫缺陷(SCID)小鼠皮下。兩周后收取標(biāo)本并進(jìn)行HE染色。結(jié)果顯示這些細(xì)胞可以形成完整的血管。冰凍切片免疫熒光染色檢測內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物,結(jié)果顯示內(nèi)皮細(xì)胞形成了組成血管內(nèi)襯的管狀結(jié)構(gòu),而誘導(dǎo)分化的SMC正確定位到了外層,包裹住內(nèi)層的內(nèi)皮小管,形成了兩層堅固的血管層。因此我們推斷由DKK3誘導(dǎo)分化而來的平滑肌具有形成體內(nèi)完整血管的功能。9.DKK3促進(jìn)Sca1+祖細(xì)胞分化為SMCSca1+細(xì)胞接種于預(yù)先鋪有膠原IV基質(zhì)的培養(yǎng)皿中并且用DM分化培養(yǎng)基培養(yǎng)。PCR和免疫印跡結(jié)果顯示SMC特異蛋白和DKK3表達(dá)量都上升。ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)基顯示Sca1+細(xì)胞向SMC的分化過程中DKK3表達(dá)量升高。免疫熒光染色顯示SMC的特異蛋白和DKK3表達(dá)都增多。用shDKK3沉默DKK3可以看到SMC特異蛋白減少,用DKK3抗體中和分泌型DKK3也可以得到相同結(jié)果。用重組DKK3蛋白或者過表達(dá)DKK3刺激細(xì)胞進(jìn)行研究,結(jié)果表明SMC特異蛋白增多。10.DKK3通過調(diào)節(jié)Wnt通路促進(jìn)Sca1+祖細(xì)胞分化用DKK3的抗體中和了 Sca1+細(xì)胞培養(yǎng)基中的DKK3因子,可以看到Wnt通路的靶基因下調(diào),用shDKK3沉默DKK3也可以得到相似的結(jié)果。我們用反轉(zhuǎn)錄實時定量PCR分析器分析小鼠的Wnt通路。當(dāng)DKK3過表達(dá)時,大部分與Wnt通路相關(guān)的基因表達(dá)明顯增加;相反,加入shDKK3時,大部分Wnt通路基因表達(dá)下降。用Wnt通路的特異性抑制劑可以發(fā)現(xiàn)Wnt通路受到抑制后Sca1+細(xì)胞分化過程中SMC特異蛋白表達(dá)減少。免疫印跡分析表明過表達(dá)DKK3導(dǎo)致小鼠Sca1+細(xì)胞中活化狀態(tài)的β-catenin增加,然而用特異性抑制劑抑制Wnt通路后,即使過表達(dá)DKK3,SMC標(biāo)志物也會減少。綜上所述,DKK3可以通過激活Wnt通路使Sca1+細(xì)胞分化為SMC。11.外源性DKK3可以減輕DKK3-/-ApoE-/小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成對DKK3-/-ApoE-/-小鼠進(jìn)行串聯(lián)狹窄手術(shù),然后在其頸動脈外膜敷上含有200μg/ml重組DKK3的pluronic凝膠。對照組采用DKK3+/+ApoE-_-小鼠,其頸動脈外膜測的pluronic凝膠中含有200μg/ml的小鼠血清蛋白。手術(shù)4周后取材切片進(jìn)行HE染色。結(jié)果顯示,凝膠中DKK3蛋白的釋放能夠極大減少DKK3-/-ApoE-/-小鼠斑塊中的紅細(xì)胞數(shù)量。免疫熒光染色結(jié)果顯示凝膠釋放DKK3可以增加DKK3-/-ApoE-/-小鼠斑塊中SMC的含量,減少CD68巨噬細(xì)胞的浸潤,與DKK3+/+ApoE-/-小鼠沒有明顯差異。天狼猩紅染色顯示兩組小鼠的細(xì)胞外基質(zhì)含量也沒有明顯差異。因此這些結(jié)果表明外源性給予DKK3同樣能夠減少斑塊內(nèi)出血和巨噬細(xì)胞浸潤、增加SMC和細(xì)胞外基質(zhì)含量,從而改變斑塊成分。12.DKK3過表達(dá)可以改變家兔動脈粥樣硬化斑塊的成分通過球囊拉傷加高脂喂養(yǎng)的方法構(gòu)建家兔晚期動脈粥樣硬化斑塊模型。喂養(yǎng)10周后,通過耳緣靜脈注射腺病毒的方法使家兔過表達(dá)DKK3。血清ELISA檢測顯示注射后DKK3持續(xù)升高。免疫組化檢測結(jié)果顯示DKK3腺病毒注射組斑塊中SMC含量明顯高于空載體注射組,而巨噬細(xì)胞浸潤明顯少于空載體注射組,而且MMP9+細(xì)胞少于空載體注射組。天狼猩紅染色結(jié)果顯示DKK3腺病毒注射組ECM含量高于空載體注射組。油紅O染色結(jié)果顯示兩組斑塊大小沒有明顯差別。13.不穩(wěn)定心絞痛患者血清中DKK3含量降低分別收集穩(wěn)定性心絞痛患者和不穩(wěn)定性心絞痛患者血清。用ELISA的方法檢測其血清中DKK3含量,結(jié)果顯示不穩(wěn)定性心絞痛患者血清DKK3水平降低。5研究結(jié)論1.我們首次證明了 DKK3是一種強(qiáng)有力的SMC分化誘導(dǎo)因子,在胚胎成纖維細(xì)胞中,DKK3可能通過與某種受體結(jié)合來激活A(yù)TF6進(jìn)而激活TGF-β1,導(dǎo)致胚胎成纖維細(xì)胞分化為平滑肌細(xì)胞。2.在Sca1+血管祖細(xì)胞中,DKK3通過間接結(jié)合到Wnt結(jié)合位點ATF6,然后激活Wnt/β-catenin通路導(dǎo)致Sca1+血管祖細(xì)胞分化為平滑肌細(xì)胞。3.DKK3通過其誘導(dǎo)分化功能增加小鼠和家兔動脈粥樣硬化易損斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞和膠原纖維、彈力纖維含量,減少巨噬細(xì)胞浸潤和斑塊內(nèi)出血的發(fā)生率,具有重要的治療作用。4.不穩(wěn)定心絞痛患者血清DKK3濃度下降,提示DKK3可能可以作為分子標(biāo)志物預(yù)測不穩(wěn)定心絞痛的發(fā)生。1.研究背景心肌纖維化是指心臟組織中膠原異常增殖、不同類型的膠原構(gòu)成比例失調(diào)、排列紊亂。任何能夠增加心臟后負(fù)荷以及影響神經(jīng)-體液的因素都可能導(dǎo)致心臟肥大和心肌纖維化,表現(xiàn)為室壁僵硬、收縮能力和灌注下降。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)激活是導(dǎo)致心肌纖維化的最重要原因。血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,AngⅡ)AngⅡ是RAAS系統(tǒng)中最重要的組分,可以直接影響心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞,導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大和成纖維細(xì)胞增殖、過度分泌細(xì)胞外基質(zhì)。因此,阻斷AngⅡ的生物學(xué)效應(yīng)必將對損傷的心肌產(chǎn)生保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(Angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)可以裂解血管緊張素Ⅱ并且形成血管緊張素1-7(Ang1-7),后者對于心肌肥厚和纖維化具有一定的保護(hù)作用,顯示出ACE2潛在的治療價值。同時,近年研究發(fā)現(xiàn),金屬蛋白酶 17(A disintegrin and metalloproteinase 17,AD AM1 7)具有降解 ACE2的功能,因此我們推測其可能與血管緊張素Ⅱ?qū)е碌男募p傷存在相關(guān)性。β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是Wnt通路的核心效應(yīng)分子,當(dāng)其在細(xì)胞質(zhì)中增多時引起細(xì)胞核轉(zhuǎn)位增多,進(jìn)而引起促心肌肥厚和纖維化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄增多,導(dǎo)致心肌纖維化和心肌肥厚。糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)是一種抗心肌肥厚激酶,游離狀態(tài)的GSK-3β可以被招募到卷曲蛋白受體(Frizzled receptor)上,從而與β-catenin結(jié)合,促進(jìn)β-catenin的降解,阻斷其核轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor,TGF-β1)的生物學(xué)功能非常廣泛,主要包括誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞合成功能、促進(jìn)成纖維細(xì)胞合成膠原、抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性等。在心肌纖維化的過程中,TGF-β1不僅調(diào)節(jié)各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,還可以直接刺激CF細(xì)胞增殖,是導(dǎo)致心肌纖維化最重要的調(diào)節(jié)因子。因此,在本實驗中我們檢測了 TGF-β1在AngⅡ誘導(dǎo)的心肌纖維化中的作用。目前,已有研究報道dickkopf-3(DKK3)對于心肌具有一定保護(hù)作用,而其在AngⅡ誘導(dǎo)的心肌纖維化中的作用尚不清楚,對心肌組織中GSK-3β/β-catenin信號通路和ADAM17/ACE2的表達(dá)變化也沒有研究,對此我們進(jìn)行了本次研究。此外我們還研究了 DKK3是否影響TGF-β1/Smad3信號通路進(jìn)而調(diào)節(jié)AngⅡ的致纖維化作用。2.研究目的本研究的目的主要有四個:(1)研究DKK3過表達(dá)是否減輕AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥厚和纖維化;(2)在AngⅡ誘導(dǎo)的心肌纖維化小鼠模型中,研究DKK3是否能夠影響GSK-3β/β-catenin信號通路;(3)研究DKK3與ADAM17/ACE2和TGF-β1信號通路的關(guān)系;(4)研究DKK3對AngⅡ誘導(dǎo)的炎癥和成纖維細(xì)胞增殖的作用。3.研究方法1.小鼠原代心臟成纖維細(xì)胞培養(yǎng)無菌條件下取新生C57BL/6小鼠的心臟,在培養(yǎng)基中剪碎后用Ⅱ型膠原酶消化三小時。離心后用完全培養(yǎng)基重懸沉淀,置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2小時后換液去除未貼壁雜質(zhì),然后繼續(xù)培養(yǎng)純化成纖維細(xì)胞以備后續(xù)實驗。2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染和藥物刺激過表達(dá)實驗首先將DKK3過表達(dá)病毒或者空載體按MOI=100加入成纖維細(xì)胞中,24小時后換液,加入1μg/ml的血管緊張素Ⅱ,共培養(yǎng)48小時后進(jìn)行后續(xù)實驗。分組如下:OV+AngⅡ組:DKK3過表達(dá)病毒+血管緊張素Ⅱ;AD+AngⅡ組:空載體病毒+血管緊張素Ⅱ;AngⅡ組:僅加血管緊張素Ⅱ;OV組:僅加DKK3過表達(dá)病毒;AD組:僅加空載體病毒;NC組:空白對照。3.細(xì)胞抑制實驗原代心臟成纖維細(xì)胞接種后生長至30%然后進(jìn)行刺激。將DKK3的小干擾RNA及對照RNA與載體混合后加入培養(yǎng)基,4小時后換液,24小時后加入1μg/ml的血管緊張素Ⅱ,再培養(yǎng)48小時,提取蛋白進(jìn)行下一步實驗。共分為四組:組1(NC-siRNA):僅添加陰性小干擾RNA;組2(NC-siRNA+Angll):加入陰性小干擾 RNA 和 AngⅡ;組 3(DKK3-siRNA+Angll):加入 DKK3 小干擾 RNA 和 AngⅡ;組 4(DKK3-siRNA):僅加入 DKK3 小干擾 RNA。4.動物實驗取60只10到12周齡的野生型C57BL/6小鼠,隨機(jī)分為4組,用微量泵以1000 ng/kg/min的速度緩慢泵入血管緊張素Ⅱ或生理鹽水,持續(xù)28天,埋泵前三天尾靜脈注射DKK3過表達(dá)腺病毒或空白病毒載體(2×109pfu),在第15天注射第二次病毒,第31天測量血壓并處死小鼠。動物實驗分組如下:組1(OV+AngⅡ):注射DKK3過表達(dá)病毒+泵入血管緊張素Ⅱ;組2(AD+Angll):注射空病毒載體+泵入血管緊張素Ⅱ;組3(OV):注射DKK3過表達(dá)病毒+泵生理鹽水;組4(AD):注射空病毒載體+泵生理鹽水。5.實時定量RT-PCR使用TRlzol試劑提取小鼠左心室的總RNA,然后用PCR熱循環(huán)儀進(jìn)行實時定量PCR,檢測心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)和β肌球蛋白重鏈(beta-myosin heavy chain,β-MHC)。具體參數(shù)為 95℃ 運(yùn)行 30 s 然后 95℃ 運(yùn)行 5 s共40個循環(huán),最后56℃運(yùn)行10 s。GAPDH用作內(nèi)參,實驗結(jié)果采用2△△CT進(jìn)行計算。6.免疫印跡(Western blot)分析使用相應(yīng)的蛋白提取試劑盒提取小鼠左心室或原代心肌成纖維細(xì)胞的總蛋白和核蛋白。各組調(diào)整相同蛋白上樣量,電泳分離不同分子量蛋白,然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上。4℃條件下孵育相應(yīng)的抗體過夜。所用一抗包括兔抗DKK3抗體、兔抗膠原Ⅰ、膠原Ⅲ抗體,兔抗磷酸化ADAM 17(T735)抗體,兔抗ACE2抗體、兔抗TGF-β1抗體、兔抗ADAM17抗體、兔抗GSK-3β抗體、兔抗磷酸化GSK-3β(Ser9)抗體、兔抗 β-catenin 抗體,兔抗活化 β-catenin(Ser33/37/Thr41)抗體、兔抗Bcl-2抗體、兔抗Bax抗體、兔抗Smad3、磷酸化Smad3(Ser423/425)抗體以及小鼠抗β-actin抗體,第二天孵育相應(yīng)二抗后用化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白表達(dá)。7.細(xì)胞增殖分析(EDU)采用EDU(5-Ethynyl-2'-deoxyuridine)染色的方法檢測細(xì)胞增殖。在染色前進(jìn)行細(xì)胞爬片并加入相應(yīng)的藥物刺激,然后加入含F(xiàn)BS和EDU的染料,多聚甲醛固定后用Triton X-100進(jìn)行細(xì)胞通透,加入甘氨酸中和多聚甲醛;用Apollo-Fluor覆蓋細(xì)胞并在室溫下避光孵育、Hoechst33342染色后避光拍照,統(tǒng)計陽性細(xì)胞的百分比。8.免疫熒光CFs細(xì)胞用4%多聚甲醛固定后用山羊血清封閉,用Triton X-100進(jìn)行細(xì)胞通透,加入兔抗active-β-catenin抗體覆蓋細(xì)胞,4℃孵育過夜。第二天加入抗兔熒光二抗,避光孵育后DAPl染核,熒光顯微鏡拍照并計數(shù)分析。9.酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)小鼠血清DKK3濃度、Ang(1-7)、炎癥因子白介素1β(IL-]β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的濃度用ELISA試劑盒檢測。操作步驟均按照試劑盒說明書進(jìn)行,重復(fù)三次取平均值。10.小鼠心功能及病理學(xué)檢測小鼠處死前(第31天)用小動物超聲儀進(jìn)行心功能的檢測。在第3天和第31天尾靜脈測量小鼠血壓。處死前測量小鼠體重和脛骨長度,處死后進(jìn)行心臟灌洗,然后吸干水分稱量心臟重量,計算心重比(HW/BW)及心脛骨比(HW/TL)。取下心臟后進(jìn)行大體標(biāo)本拍照比較。11.組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)小鼠心臟取下后浸泡在4%多聚甲醛中,24小時后流水沖洗過夜,在心尖部中下1/3的位置進(jìn)行石蠟包埋。然后切片,厚度為5μm。進(jìn)行HE、Masson染色。免疫組織化學(xué)所用一抗為兔抗ACE2、兔抗膠原Ⅰ、膠原Ⅲ,兔抗CD45、CD68以及兔抗IL-6,二抗為北京中山金橋公司生產(chǎn)試劑盒,按照說明書進(jìn)行操作,應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。4.研究結(jié)果泵入血管緊張素后,尾靜脈注射DKK3過表達(dá)病毒的小鼠比僅注射生理鹽水的小鼠心臟肥大和間質(zhì)纖維化水平明顯減輕,而且心肌肥大相關(guān)指標(biāo)ANP和β-MHC明顯減少;纖維化相關(guān)指標(biāo)膠原Ⅰ和膠原Ⅲ明顯減少,心肌炎癥反應(yīng)降低;在體外實驗中,DKK3過表達(dá)還可以減少心肌成纖維細(xì)胞的增殖和炎癥反應(yīng),抑制磷酸化GSK-3β表達(dá),減少β-catenin核轉(zhuǎn)錄;另外DKK3過表達(dá)可以降低磷酸化的ADAM]7的表達(dá),進(jìn)而增加ACE2的表達(dá),促進(jìn)血管緊張素Ⅱ的降解,增加Ang(1-7)的含量;當(dāng)敲減DKK3時,磷酸化ADAM17表達(dá)增多,導(dǎo)致ACE2表達(dá)下降。同時,DKK3過表達(dá)還可以抑制AngⅡ誘導(dǎo)的TGF-β1信號通路激活,DKK3敲減可以增強(qiáng)TGF-β1信號通路。5.研究結(jié)論DKK3過表達(dá)能夠抑制血管緊張素Ⅱ引起的心肌肥厚和纖維化,其機(jī)制與抑制GSK-3β和β-catenin,并且減少β-catenin核轉(zhuǎn)錄有關(guān);另外DKK3過表達(dá)可以降低磷酸化的ADAM17的表達(dá),進(jìn)而增加ACE2的表達(dá),促進(jìn)AngⅡ的降解,增加Ang(1-7)的含量;同時,DKK3還可以抑制AngⅡ誘導(dǎo)的TGF-β1信號通路激活。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R543.5;R542.23
【圖文】：

圖１丨）ＫＫ３（ｄｉｃｋｋｏｐｆ）敲除加重ＡＳ病變進(jìn)展，提高斑塊內(nèi)出血發(fā)生率逡逑串聯(lián)狹窄手術(shù)后四周不穩(wěn)定性動脈粥樣硬化斑塊

圖２邋ＤＫＫ３敲除減少ＡＳ斑塊中ＳＭＣ含量逡逑小鼠頸動脈串聯(lián)狹窄手術(shù)后４周取材進(jìn)行免疫熒光染色。逡逑（Ａ，Ｂ）免疫熒光染色檢測斑塊中ＳＭＡ邋（平滑肌肌動蛋白）的含量。（Ｃ）陽性逡逑細(xì)胞的統(tǒng)計圖（結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，ｎ＝１０，邋＊Ｐ＜０．０５）。逡逑

邋ＤＫＫ３敲除增加ＡＳ斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤，減少ＥＣＭ但對斑塊大小無影響逡逑小鼠頸動脈串聯(lián)狹窄手術(shù)后４周取材進(jìn)行免疫熒光染色和天狼猩紅染色并逡逑其斑塊面積。逡逑（Ａ．邋Ｂ）免疫熒光染色檢測兩組小鼠頸動脈斑塊中ＣＤ６８含量，Ｂ圖左卜＇角插逡逑

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 陳文強(qiáng),張運(yùn),張梅,季曉平,殷樂,朱永鋒;Establishing an animal model of unstable atherosclerotic plaques[J];Chinese Medical Journal;2004年09期

本文編號：2791281