【摘要】：目的:研究鈣通道相關(guān)基因CASQ2和RYR2在二乙酰嗎啡致心律失常中的作用及意義。方法:離體培養(yǎng)原代大鼠乳鼠心肌細(xì)胞,以不同濃度二乙酰嗎啡作用于心肌細(xì)胞,觀察心肌細(xì)胞形態(tài)和自發(fā)性搏動(dòng)頻率及節(jié)律改變。采用膜片鉗技術(shù)檢測(cè)二乙酰嗎啡干預(yù)后心肌細(xì)胞動(dòng)作電位及鈣離子通道改變。實(shí)驗(yàn)分3組:對(duì)照組(N組)、二乙酰嗎啡組(H組)、二乙酰嗎啡+維拉帕米組(H+V組)。采用免疫熒光技術(shù)對(duì)各組細(xì)胞中的CASQ2和RYR2蛋白熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)。通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)和蛋白印跡(Western blot)法分別檢測(cè)各組細(xì)胞中的CASQ2和RYR2基因的mRNA和蛋白表達(dá)量。結(jié)果:不同濃度的二乙酰嗎啡作用于原代大鼠乳鼠心肌細(xì)胞后,隨著二乙酰嗎啡濃度升高,心肌細(xì)胞形態(tài)變化明顯,細(xì)胞數(shù)量減少,細(xì)胞體積縮小,偽足數(shù)量減少;細(xì)胞核形態(tài)改變,結(jié)構(gòu)模糊;心肌細(xì)胞自發(fā)性搏動(dòng)頻率及節(jié)律改變,結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。二乙酰嗎啡作用于心肌細(xì)胞后,L型鈣通道電流I-V曲線上移,峰值與對(duì)照組相比明顯降低(對(duì)照組-14.4687?3.6107,實(shí)驗(yàn)組組-4.9662?0.7708(24h)、-3.7570?2.0602(48h)),動(dòng)作電位中APD90顯著增加,RP負(fù)值降低,APA顯著減小,結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn),N組CASQ2主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì),RYR2主要表達(dá)于細(xì)胞核;H組CASQ2在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)降低而細(xì)胞核表達(dá)升高,RYR2在細(xì)胞核表達(dá)降低而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)升高;H+V組CASQ2在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)位置均有表達(dá),RYR2在細(xì)胞核表達(dá)減少,在細(xì)胞質(zhì)少量表達(dá);與N組相比,H組和H+V組CASQ2和RYR2平均熒光強(qiáng)度降低,蛋白表達(dá)降低,結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。通過qRT-PCR檢測(cè)3組中CASQ2和RYR2基因的mRNA水平表達(dá)量,結(jié)果顯示:H組和H+V組與N組相比,CASQ2和RYR2 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低,結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);H組與H+V組相比,CASQ2和RYR2的mRNA表達(dá)量無明顯差異,結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。采用Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與N組相比,H組和H+V組中CASQ2和RYR2蛋白表達(dá)量降低,結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);H+V組與H組相比,CASQ2和RYR2蛋白表達(dá)量降低,結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:二乙酰嗎啡可致原代大鼠乳鼠心肌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,自發(fā)性搏動(dòng)頻率及節(jié)律發(fā)生改變,電生理功能發(fā)生改變。維拉帕米對(duì)二乙酰嗎啡引起的原代心肌細(xì)胞自發(fā)性搏動(dòng)頻率減少有一定的改善作用。CASQ2和RYR2基因與二乙酰嗎啡引起的原代大鼠乳鼠心肌細(xì)胞動(dòng)作電位改變及鈣離子通道異常相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：新疆醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R541.7
【圖文】：

新疆醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文結(jié) 果1 原代大鼠乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)純度鑒定培養(yǎng)至第 7d 的原代心肌細(xì)胞經(jīng)激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)鑒定：原代心肌細(xì)胞中可檢測(cè)到 -Actin 表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi) FITC 標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG 抗體與心肌細(xì)胞特異蛋白 -Actin 一抗結(jié)合，經(jīng) 488nm 激光激發(fā)出現(xiàn)網(wǎng)格狀或絲狀綠色熒光（圖 1.b），DAPI染料與細(xì)胞核結(jié)合，經(jīng)紫外光激光激發(fā)后出現(xiàn)圓形或橢圓形的藍(lán)色熒光（圖 1.a），合成結(jié)果可見原代心肌細(xì)胞完整形態(tài)結(jié)構(gòu)，原代心肌細(xì)胞呈多種形態(tài)，有三角形、梭形、多邊形等，細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白呈絲狀分布，交織成網(wǎng)絡(luò)（圖 1.c）。每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)隨機(jī)取 5 個(gè)視野，同時(shí)表達(dá)藍(lán)色熒光和綠色熒光的細(xì)胞為陽性細(xì)胞，表達(dá)藍(lán)色熒光的數(shù)量記為細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞所占比例，結(jié)果顯示原代培養(yǎng)的大鼠乳鼠心肌細(xì)胞純度＞97%，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

改變數(shù)量增多。采用細(xì)胞形態(tài)及搏動(dòng)狀態(tài)改變明顯的 10-4mol/L 二乙酰嗎啡濃度進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)，即為后續(xù)試驗(yàn) H 組，10-4mol/L 二乙酰嗎啡和維拉帕米干預(yù)組為后續(xù)試驗(yàn) H+V 組。采用 Dunnett-t 檢驗(yàn)法用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出：與正常對(duì)照組相比，二乙酰嗎啡組自發(fā)性搏動(dòng)頻率降低，P=0.000，說明二乙酰嗎啡對(duì)心肌細(xì)胞自發(fā)性搏動(dòng)頻率有影響；與二乙酰嗎啡組相比，二乙酰嗎啡+維拉帕米組自發(fā)性搏動(dòng)頻率升高，P=0.02（表 5），說明維拉帕米對(duì)此過程有一定的保護(hù)作用。a) b) c)

同濃度二乙酰嗎啡干預(yù)心肌細(xì)胞 24 小時(shí)細(xì)胞形態(tài)改(0, 10-5mol/L, 10-4mol/L, 10-3mol/L, 10-2mol/L)作用心數(shù)據(jù)三次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)，*P< 0.05。es of cardiomyocytes with morphological changes undne. Cardiomyocytes were switched to ium containing , 10-5mol/L, 10-4mol/L, 10-3mol/L, 10-2mol/L) in 24 hou Means±SEM of three independent experiments, *P< 表 5 不同分組中心肌細(xì)胞自發(fā)性搏動(dòng)頻率( x s, n=1ous beating frequency of cardiomyocytes in different g頻率(次) P 值129.86 7.6989.57 20.63 0.000*組 103.93 14.28 0.02#比，*P＜0.05；與二乙酰嗎啡組相比，#P＜0.05。

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