發(fā)布時間：2020-08-08 22:47

【摘要】：目的:血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)在體內(nèi)位于骨髓的低氧微環(huán)境中,然而目前所廣泛采用的EPCs擴(kuò)增方法都是非生理環(huán)境的空氣(常氧,～20%02)中,實驗擬比較骨髓微環(huán)境更為相似的低氧條件(1%02)與常氧(～20%02)兩種條件對體外擴(kuò)增人骨髓來源的EPCs干性的影響,并通過高通量測序的方法初步探究其內(nèi)在的機(jī)制,為改進(jìn)EPCs的體外擴(kuò)增方法提供更充分的理論依據(jù)。方法:1.從人骨髓中分離出EPCs,分別在常氧(20%02)和低氧條件(1%02)下培養(yǎng),通過細(xì)胞計數(shù)計算群體倍增時間來確定EPCs的體外擴(kuò)增能力;通過細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色檢測EPCs細(xì)胞衰老;以及以qRT-PCR檢測衰老相關(guān)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白P16的表達(dá);2.采用克隆形成實驗觀察常氧和低氧兩組的原代和第5代EPCs的克隆形成能力;通過體外成血管實驗觀察兩組的EPCs成血管能力;以Transwell遷移實驗觀察其遷移的能力;3.以全轉(zhuǎn)錄組RNA高通量測序(RNA-seq)篩選常氧和低氧條件培養(yǎng)的EPCs的差異表達(dá)基因(Differentially expressed genes,DEGs),并對這些DEGs進(jìn)行生物信息學(xué)分析,包括GO功能富集分析和KEGG pathway分析,以Western blotting檢測代表性蛋白從而做進(jìn)一步驗證。結(jié)果:1.與1%O_2低氧培養(yǎng)條件相比,常氧條件培養(yǎng)的EPCs生長速率較慢,群體倍增時間明顯增加(P0.05),衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色中衰老細(xì)胞的比例明顯增加(P0.05),衰老相關(guān)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白P16表達(dá)明顯增加(P0.01)。2.與1%02低氧條件相比,常氧條件下體外擴(kuò)增的原代(P0.01)和第5代(P0.01)EPCs克隆形成能力均顯著下降;常氧條件下細(xì)胞的體外成管狀結(jié)構(gòu)的長度明顯降低(P0.05),Transwell遷移實驗證實遷移的細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P0.05)。3.RNA-seq總共篩選出48個DEGs,GO和KEGG生物信息學(xué)分析顯示代謝相關(guān)通路:細(xì)胞對脂肪酸的反應(yīng)、酮體的合成和降解;細(xì)胞增殖相關(guān)通路:涉及有絲分裂細(xì)胞周期的泛素蛋白連接酶的調(diào)節(jié)、p53信號通路等顯著富集。Western blotting檢測了DEGs中增殖相關(guān)的蛋白,包括p53、IGFBP3、CCNB1和GDF15。WB結(jié)果顯示與1%02低氧組相比,常氧條件擴(kuò)增的EPCs中p53(P0.05)和GDF15(P0.05)表達(dá)顯著上調(diào),兩組間IGFBP3和CCNB1的表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論:1%O_2低氧條件相對于目前廣泛采用的常氧條件更有利于人骨髓來源的EPCs的體外擴(kuò)增,減少細(xì)胞衰老,增強(qiáng)EPCs的克隆形成能力、體外成血管能力和遷移能力,因此有利于干細(xì)胞干性的保持。包括p53信號通路在內(nèi)的多種信號通路與低氧維持EPCs干細(xì)胞干性相關(guān)。本研究有助于改進(jìn)目前所廣泛采用的傳統(tǒng)的EPCs擴(kuò)增方法,提高EPCs的體外擴(kuò)增效率。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R54
【圖文】：

接下來我們比較了在常氧條件下和１％0２低氧條件下原代和第５代ＥＰＣｓ的逡逑集落形成能力。將原代和第５代ＥＰＣｓ分別在常氧或低氧（１％０２）條件下培養(yǎng)逡逑約８天后計數(shù)大于５０個細(xì)胞的克隆的數(shù)目。如圖２－２Ａ和圖２－２Ｂ所示，相比于逡逑１％0２低氧條件，常氧條件下原代ＥＰＣｓ的集落形成能力顯著降低＜０．０１），逡逑差異有統(tǒng)計學(xué)意義；如圖２－２Ｃ和圖２－２Ｄ所示，相比于１％０２低氧條件，常氧逡逑條件下第５代ＥＰＣｓ的集落形成能力也顯著降低（Ｐ＜０．０１邋）。逡逑１８逡逑

石頁士學(xué)位論文ｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇＯｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ａｌｌ／ＧＣＦ／０００／００１／４０５／ＧＣＦ＿０００００１４０５．２６的表達(dá)定量分析由ｓｔｒｉｎｇｔｉｅ軟件完成，基因表達(dá)的計算方法為：邋ｎｕｍｂｅｒ邋ｏｆ邋Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ邋Ｐｅｒ邋Ｋｉｌｏｂａｓｅ邋ｏｆ邋ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ｐｅｒ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ），即每百萬ｆｒａｇｍｅｎｔｓ中來自某一基因每千堿基Ｈ。在基因定量結(jié)果的基礎(chǔ)上，米用Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ軟件ｃｕｆｆｄｉｆｆ分析。差異結(jié)果的篩選標(biāo)準(zhǔn)為｜ｌ0ｇ２Ｒａｔｉｏｇｌ且ｑｖａｌｕｅ＾Ｏ．０５。逡逑達(dá)水平散點圖分布見下圖．？逡逑邋邐逡逑

３．３．２對差異衣達(dá)基因進(jìn)行ＫＥＧＧ邋ｐａｔｈｗａｙ功能分析逡逑對差異表達(dá)基因進(jìn)行ＫＥＧＧ邋ｐａｔｈｗａｙ分析有助于／解ＤＥＧｓ的生物學(xué)功能。逡逑ＫＥＧＧ分析結(jié)果顯示富集了邋６條通路（表３－８，

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本文編號：2786217