【摘要】：LKB1通過Hippo-Yap信號在心肌細胞增殖中的作用研究研究背景:在全世界范圍內(nèi),隨著社會的發(fā)展和人們生活水平的提高,心肌梗死的發(fā)病率和死亡率不斷上升。心肌梗死的發(fā)生通常是指冠狀動脈的血流急劇減少或者中斷而導(dǎo)致的心肌缺血性壞死。心梗發(fā)生之后,大量心肌細胞死亡,纖維瘢痕形成,心功能明顯受損。傳統(tǒng)觀點認為心臟是一種終末分化器官,成年哺乳動物心肌細胞退出細胞周期循環(huán),失去了增殖的能力。近年來的研究發(fā)現(xiàn),心臟是不斷更新的器官,人類心肌細胞的更新率隨年齡的增大而逐漸降低,在20歲時心肌細胞的年更新率為1%,到75歲時降至0.3%。但是心肌細胞這種微弱的增殖能力并不足以彌補心肌梗死后死亡的細胞。研究表明,以小鼠為例,小鼠的心肌細胞在出生后一周以內(nèi)增殖能力明顯下降,到出生后三周,增殖能力在正常情況下幾乎完全消失。如何更大程度地促進心肌細胞增殖用以補充死亡的心肌細胞是現(xiàn)階段心肌再生研究的重點。肝臟激酶B1(LKB1)作為一種絲/蘇氨酸激酶被廣泛研究,它在細胞極性、細胞增殖和腫瘤抑制中發(fā)揮著重要的作用。我們發(fā)現(xiàn)LKB1的表達與小鼠出生后心肌細胞增殖能力密切相關(guān)。出生后第一天LKB1表達量較低,隨著心肌細胞增殖能力的降低,LKB1表達量逐漸升高。因此,我們推測當抑制LKB1的表達時,心肌細胞的增殖能力提高。而我們的前期研究剛好證明了,在心肌細胞中,當LKB1表達降低時,心肌細胞增殖能力增強。但是LKB1如何參與并調(diào)控心肌細胞的增殖,目前尚不十分清楚。研究顯示,Hippo-YAP信號通路是參與心肌細胞增殖的關(guān)鍵信號,YAP作為轉(zhuǎn)錄因子參與細胞周期的調(diào)控。細胞周期的調(diào)控是一個涉及多種信號的分子的復(fù)雜過程,然而,YAP是否參與LKB1降低對心肌細胞增殖的調(diào)控,目前尚無相關(guān)報道。因此,本研究提出LKB1降低通過YAP信號調(diào)控心肌細胞增殖的假設(shè),通過體外建立LKB1 siRNA處理模型和成年小鼠心梗的AAV9感染模型,檢測LKB1降低時對心肌細胞增殖能力的影響,并通過對YAP和Cyclin D的檢測和調(diào)控,明確LKB1降低調(diào)控心肌細胞增殖的作用機制。研究方法:1.以C57/BL6小鼠為研究對象,通過提取小鼠不同時間點(出生后1,7,28天)的心臟RNA,比較心臟中LKB1的表達。明確隨著時間的推移心肌細胞增殖能力的降低,心臟中LKB1的表達變化。2.以新生乳鼠的心肌細胞為研究對象,通過LKB1 siRNA干擾處理,觀察心肌細胞中LKB1表達降低,心肌細胞增殖能力的變化。通過免疫熒光染色的方法,以心肌細胞核中Ki67,pH3為衡量指標,計算心肌細胞的Ki67,pH3的陽性率,比較LKB1降低之后Ki67,pH3陽性率的變化。明確LKB1降低對心肌細胞增殖具有調(diào)控作用。3.以C57/BL6小鼠為研究對象,通過結(jié)扎小鼠心臟左前降支血管建立小鼠心梗模型,通過AAV9-LKB1-GFP-shRNA病毒心包注射到小鼠心臟,觀察小鼠心臟中心肌細胞Edu的陽性率,明確LKB1降低能夠促進成年小鼠心肌細胞的增殖。4.通過WB實驗檢查在LKB1降低的條件下心肌細胞中YAP和Cyclin D的變化情況。明確在LKB1降低的條件下,YAP對心肌細胞增殖具有調(diào)控作用。結(jié)果:1.隨著小鼠出生之后心肌細胞增殖能力的下降,心臟中LKB1的表達增加:通過提取心臟組織中的總RNA,比較不同時間點(出生后1天,7天,28天)心臟中LKB1的表達發(fā)現(xiàn)在小鼠心肌細胞增殖能力最強的時候(出生后1天),心肌細胞中LKB1的表達最低,出生后7天,28天心臟中LKB1的表達均明顯高于出生后1天。2.通過LKB1 siRNA干擾的方法降低心肌細胞中LKB1的表達,發(fā)現(xiàn)心肌細胞的增殖指標Ki67,pH3均明顯升高:提取新生乳鼠心肌細胞之后使用LKB1 siRNA處理之后,通過免疫熒光的方式比較心肌細胞核中Ki67,pH3的表達,發(fā)現(xiàn)LKB1表達降低可以促進心肌細胞增殖。3.構(gòu)建AAV9-LKB1-GFP-shRNA病毒載體,建立成年小鼠心梗模型,發(fā)現(xiàn)在小鼠心梗之后注射病毒可以提高心肌細胞增殖能力:在小鼠心梗模型建立之后,心包注射病毒,兩周之后檢查Edu的心肌細胞陽性率,發(fā)現(xiàn)心肌細胞增殖增加。4.WB結(jié)果顯示,LKB1 siRNA處理顯著提高心肌細胞中YAP和Cyclin D的表達,同時降低YAP的磷酸化活性。提示我們在LKB1表達降低時,YAP參與了心肌細胞增殖的調(diào)控。結(jié)論:LKB1降低后,心肌細胞YAP活性升高,通過下調(diào)YAP的磷酸化水平,引起細胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D表達升高,最后心肌細胞增殖能力增加。該結(jié)論進一步豐富了我們對心肌細胞增殖能力調(diào)控的理論知識,為心梗病人的心肌細胞損害的治療提供了新的靶點。鳶尾素對心肌梗死的保護作用研究研究背景:在全世界范圍內(nèi),心肌梗死的發(fā)病率和死亡率日益增高。冠狀動脈的血流急劇減少或者中斷而導(dǎo)致的心肌缺血性壞死會造成大量心肌細胞死亡,纖維瘢痕生成,心功能明顯受損。而鳶尾素作為一種在運動過程中由骨骼肌分泌的一種蛋白,對多種器官的損傷具有保護作用。在我們之前的研究中發(fā)展鳶尾素對心肌的缺血再灌注損傷具有明顯的保護作用,我們猜想,鳶尾素可能同樣會對心肌梗死有保護作用。研究方法:1.首先為了明確鳶尾素對心肌梗死的作用,我們建立了小鼠的心肌梗死模型,外源性給予鳶尾素(5ug/g/d),腹腔注射給藥連續(xù)兩周,分別在心肌梗死后7天,14天,28天的時候觀察小鼠的心功能,同時在心梗后28天檢測心肌的纖維化程度。2.然后為了觀察鳶尾素對心肌細胞凋亡和血管新生的影響,我們利用Tunel染色的方法比較心肌梗死2天后心肌細胞凋亡的數(shù)目,同時用免疫熒光染色觀察心梗后14天梗死區(qū)域血管新生的情況。3.最后為了明確鳶尾素對血管新生的影響,我們以人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)為研究對象,分別用鳶尾素和U0126處理,通過Westernblot觀察其對ERK的影響變化,同時通過細胞體外遷移能力測定觀察HUVEC的遷移情況。研究結(jié)果:1.在心肌梗死之后,外源性給予鳶尾素處理之后,在心梗后7天,14天,28天對小鼠心功能檢測發(fā)現(xiàn),鳶尾素處理之后在心梗后28天小鼠心功能明顯提高,同時在心梗后28天發(fā)現(xiàn)小鼠的心肌纖維化程度降低。2.在心梗后兩天Tunel染色發(fā)現(xiàn),鳶尾素給藥的小鼠,心肌細胞Tunel染色陽性明顯降低,提示心肌細胞凋亡減少,同時通過CD31免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),心梗后14天,鳶尾素給藥小鼠,心肌梗死邊緣區(qū)CD31表達增加,提示有新生血管形成。3.Westernblot的結(jié)果提示我們鳶尾素可以促進ERK的磷酸化但是這種促進作用可以被U0126阻斷。同時細胞遷移能力測定提示我們鳶尾素處理之后,內(nèi)皮細胞遷移明顯增加,而在同時應(yīng)用U0126之后,可以減少內(nèi)皮細胞的遷移。結(jié)論:鳶尾素通過減少心肌細胞凋亡,減輕心肌纖維化程度以及促進血管新生對心肌梗死發(fā)揮治療作用,并且鳶尾素促進新生血管的形成是通過ERK信號介導(dǎo)的。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R542.22
【圖文】：

陸軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文3.2 在新生乳鼠心肌細胞當中，LKB1 表達降低促進心肌細胞增殖。原代培養(yǎng)的大鼠心肌細胞隨機分為兩組，一組為對照組（+scramble siRNA 組），一組為實驗組（+LKB1 siRNA 組），干擾處理 48 小時之后，提取細胞 RNA，通過熒光定量 PCR 檢測發(fā)現(xiàn)實驗組中 LKB1 的表達明顯降低(圖 3-2 A)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，新生乳鼠心肌細胞中 LKB1 表達降低之后，免疫熒光染色提示心肌細胞 Ki67(圖 3-2B)(標尺=50μm), pH3(圖 3-2C)(標尺=50μm)的陽性率明顯增加（n=5; *P<0.05）。

圖 3-3：AAV9-LKB1-GFP-shRNA 病毒促進成年小鼠心肌細胞增殖A：AAV9-LKB1-GFP-shRNA 病毒的對 LKB1 表達的影響, p＜0.05，n=3;B：AAV9-LKB1-GFP-shRNA 病毒對心肌細胞的感染，GFP 代表 AAV9 病毒，紅色代表 cTnT心肌細胞；C：MI 后用 AAV9-LKB1-GFP-shRNA 病毒處理對心肌細胞 Edu 陽性率的影響，B1 為免疫熒光圖片，B2 為統(tǒng)計圖，箭頭表示 Edu 陽性的心肌細胞。3.4. LKB1 降低促進 YAP 介導(dǎo)的 Cyclin D 的表達原代培養(yǎng)的大鼠心肌細胞隨機分為兩組，其中一組為對照組（scramble siRNA 組），另一組為實驗組（LKB1 siRNA 組）。干擾處理 48 小時后，分別提取總蛋白，WB 檢測發(fā)現(xiàn)實驗組中 YAP 表達明顯升高，同時 YAP 的磷酸化減少（圖 3-4 A），而細胞周期蛋白 Cyclin D 表達上升（圖 3-4 B）。（n=6; *P<0.05）。

26圖 3-4：LKB1 表達降低對心肌細胞 YAP 和 Cyclin D 的影響A: WB 結(jié)果表示 LKB1 siRNA 處理之后，YAP(A2)和 YAP 磷酸化(A3)的變化，n=6; P<0.05B: WB 結(jié)果表示 LKB1 siRNA 處理之后，Cyclin D 的變化，n=6; P<0.05

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