【摘要】：第一部分動(dòng)脈粥樣斑塊鐵沉積及局灶鐵調(diào)素自分泌的介導(dǎo)機(jī)制研究目的:探討斑塊巨噬細(xì)胞鐵調(diào)素(Hepcidin)自分泌介導(dǎo)的鐵沉積在動(dòng)脈粥樣硬化(AS)斑塊形成中的作用及其潛在分子機(jī)制方法:將40只ApoE~(-/-)雌性小鼠隨機(jī)分為普通飼料組(ND)、高脂飼料組(HFD),每組20只,并以15只相同遺傳背景下的野生型C57BL/6J小鼠為對(duì)照組(WT)。喂養(yǎng)16周后,收集各組主動(dòng)脈組織并進(jìn)行主動(dòng)脈整體油紅O染色和主動(dòng)脈弓橫截面HE染色以評(píng)價(jià)各組小鼠AS斑塊形成情況;采用免疫熒光雙染法及免疫組化實(shí)驗(yàn)分別對(duì)人頸動(dòng)脈和各組小鼠AS斑塊中的巨噬細(xì)胞和ox-LDL、TLR4、p-p65、Hepcidin及ferritin-L進(jìn)行共定位染色;熒光定量PCR檢測(cè)各組小鼠主動(dòng)脈斑塊組織中TLR4、Hepcidin、甘露糖受體及ferritin-L的基因轉(zhuǎn)錄水平。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞進(jìn)行不同處理,包括轉(zhuǎn)染Hepcidin siRNA及Control siRNA以及ox-LDL、TLR4信號(hào)通路激活劑(LPS)和抑制劑(TAK-242)、Hepcidin、檸檬酸鐵胺(FAC)、鐵螯合劑(DFO)、27-羥基膽固醇(27HC)及環(huán)孢菌素A(Cyclosporin A)的干預(yù)。Western blot檢測(cè)TLR4、p-p65、Hepcidin、ferritin-L、鐵蛋白重鏈(ferritin-H)、膽固醇27-羥化酶(CYP27A1)及系列膽固醇攝取及外流相關(guān)蛋白表達(dá)水平;檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞可變鐵池;對(duì)細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色、測(cè)定細(xì)胞總膽固醇和游離膽固醇水平并進(jìn)行細(xì)胞膽固醇外流實(shí)驗(yàn)和ox-LDL攝取實(shí)驗(yàn)。結(jié)果:1)主動(dòng)脈整體油紅O染色和主動(dòng)脈弓橫截面HE染色結(jié)果顯示,與WT和ND組相比,HFD組小鼠主動(dòng)脈斑塊損傷面積增加約72%(P0.05)。與WT和ND組相比,ox-LDL、TLR4、p-p65、Hepcidin、ferritin-L與巨噬細(xì)胞在HFD組小鼠主動(dòng)脈斑塊中的共定位更為廣泛,且多見(jiàn)于斑塊泡沫細(xì)胞聚集處。此外,HFD組小鼠主動(dòng)脈斑塊組織中TLR4、Hepcidin、ferritin-L及甘露糖受體(巨噬細(xì)胞標(biāo)記)的mRNA水平顯著高于ND和WT組(P0.05),且Hepcidin mRNA水平分別與甘露糖受體、TLR4及ferritin-L基因轉(zhuǎn)錄水平間存在正相關(guān)關(guān)系(P0.01)。2)RAW264.7巨噬細(xì)胞中,ox-LDL(50μg/mL)可誘導(dǎo)TLR4、p-p65及Hepcidin蛋白表達(dá)水平分別升高約55%、34%和48%(P0.05),并使細(xì)胞ferritin-L、ferritin-H蛋白表達(dá)水平分別上調(diào)約60%和42%(P0.05),細(xì)胞內(nèi)游離鐵水平升高約48%(P0.05),并增加細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積水平。上述指標(biāo)在使用LPS特異性激活TLR4/NF-κB信號(hào)通路后進(jìn)一步顯著上升(P0.05);而TAK-242(TLR4抑制劑)的作用則完全相反(P0.05)。3)對(duì)轉(zhuǎn)染了Hepcidin siRNA的巨噬細(xì)胞進(jìn)行ox-LDL處理使細(xì)胞TLR4和p-p65蛋白表達(dá)較Control siRNA組分別上升了約41%和34%(P0.05),并可與FAC聯(lián)合作用進(jìn)一步顯著上調(diào)TLR4、p-p65蛋白表達(dá)水平,加速細(xì)胞泡沫化,表現(xiàn)為油紅O染色面積及細(xì)胞內(nèi)總膽固醇和游離膽固醇水平顯著上升,且由HDL和ApoAⅠ介導(dǎo)的膽固醇流出率較Control siRNA組分別下降了35%和68%(P0.05);相反,在經(jīng)Hepcidin預(yù)處理的巨噬細(xì)胞中,采用DFO螯合細(xì)胞內(nèi)鐵則可顯著下調(diào)細(xì)胞TLR4及p-p65蛋白表達(dá),并有效拮抗ox-LDL對(duì)TLR4和p-p65蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)作用,且伴有細(xì)胞泡沫化水平顯著降低。4)Hepcidin干預(yù)可顯著下調(diào)巨噬細(xì)胞CYP27A1蛋白表達(dá)(僅為對(duì)照組的50%,P0.05),誘導(dǎo)CD36表達(dá)(較對(duì)照組上升了約31%,P0.05)促進(jìn)膽固醇攝取,并使LXRα、ABCA1及ABCG1表達(dá)較對(duì)照組分別下降了約31%、29%和37%(P0.05),減少巨噬細(xì)胞膽固醇流出,增加細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平(約為對(duì)照組的1.4倍,P0.05)。結(jié)論:Ox-LDL通過(guò)激活TLR4/NF-κB信號(hào)通路引發(fā)的AS斑塊巨噬細(xì)胞Hepcidin自分泌是斑塊鐵沉積發(fā)生的重要誘因。巨噬細(xì)胞Hepcidin自分泌誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鐵潴留可反向激活TLR4/NF-κB信號(hào)通路,并由此形成由TLR4/NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的Hepcidin自分泌-鐵潴留惡性循環(huán),進(jìn)而誘發(fā)CYP27A1/27HC軸調(diào)節(jié)障礙,擾亂由CD36及PPARγ-LXRα-ABCA1/G1共同維持的巨噬細(xì)胞膽固醇穩(wěn)態(tài)而加速細(xì)胞泡沫化。第二部分高脂高鐵膳食對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠鐵脂代謝的影響:i TRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)研究分析目的:通過(guò)高脂高鐵膳食喂養(yǎng)Apo E-/-小鼠,對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化“鐵假說(shuō)”進(jìn)行驗(yàn)證,并運(yùn)用i TRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)方法探討膳食高脂高鐵對(duì)Apo E-/-小鼠鐵脂代謝的影響及潛在分子機(jī)制。方法:將60只Apo E-/-雌性小鼠隨機(jī)分為普通飼料組(ND)、高脂飼料組(HFD)及高脂高鐵飼料組(HFD+Fe),每組20只,并以15只相同遺傳背景下的野生型C57BL/6J小鼠為對(duì)照組(WT)。喂養(yǎng)16周后,收集各組主動(dòng)脈及肝臟組織并進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(cè);測(cè)定血脂、血清鐵水平及血清β-羥基丁酸、乳酸、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平。檢測(cè)肝臟脂質(zhì)水平,總鐵含量及ATP、乙酰輔酶A及氧化損傷與細(xì)胞凋亡水平。提取ND、HFD及HFD+Fe組小鼠肝臟總蛋白,經(jīng)酶解后,使用i TRAQ試劑進(jìn)行標(biāo)記,隨后取等量的各標(biāo)記樣品進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析及檢測(cè)、數(shù)據(jù)處理與深入的生物信息學(xué)分析。采用熒光定量PCR、Western blot及相關(guān)生化指標(biāo)檢測(cè)等方法對(duì)相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。提取并培養(yǎng)原代小鼠肝細(xì)胞。單獨(dú)使用游離脂肪酸(FFA)或聯(lián)合檸檬酸鐵胺(FAC)處理肝細(xì)胞,檢測(cè)各組細(xì)胞TG水平。Western blot及免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞CD36及脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)家族蛋白表達(dá)水平,檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞對(duì)游離脂肪酸的攝取能力。免疫熒光雙染法檢測(cè)細(xì)胞中游離脂肪酸與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的共定位。結(jié)果:1)HFD+Fe組小鼠主動(dòng)脈斑塊面積與HFD組相比下降了近65%(P0.05),血清TC、TG及LDL-C水平分別較HFD組降低了約25%、30%和70%(P0.05),且該組小鼠肝臟TC和TG水平僅約為HFD組的65%和70%(P0.05)。2)HFD+Fe組小鼠血清鐵、肝臟總鐵及鐵蛋白表達(dá)水平較HFD組升高了約42%、51%和57%(P0.01),肝臟普魯士藍(lán)呈現(xiàn)大面積藍(lán)染。3)小鼠肝臟i TRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果顯示,HFD與ND組間差異表達(dá)蛋白共計(jì)333種(變化倍數(shù)1.5或0.67,P0.05),這些蛋白主要參與的代謝通路包括脂肪酸代謝、脂肪酸降解、過(guò)氧化物酶體及谷胱甘肽代謝等。HFD+Fe與HFD組間差異表達(dá)蛋白共計(jì)203種,其主要參與的KEGG通路包括三羧酸(TCA)循環(huán)、丙酮酸代謝、谷胱甘肽代謝和脂肪酸降解等。4)與ND組相比,HFD小鼠肝臟FASN和磷酸化乙酰輔酶A羧化酶(p-ACC)表達(dá)分別下降了約55%和65%(P0.05);乙酰輔酶A脫氫酶(ACADS)、乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶(ACAT1)及過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)等表達(dá)分別上升了約64%、88%和95%(P0.01)。相反,HFD+Fe與HFD組相比,其肝臟內(nèi)源性脂肪酸合成通路呈顯著性增強(qiáng)狀態(tài)[FASN、硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)表達(dá)分別上升了約85%和70%(P0.05)],而脂肪酸β氧化通路明顯受阻[ACADS、ACAT1、PPARα及羥基輔酶A脫氫酶(HADH)表達(dá)顯著下調(diào),血清β羥基丁酸水平下降約63%(P0.05)]。5)與HFD組相比,HFD+Fe組小鼠肝臟中參與脂肪酸攝取與轉(zhuǎn)運(yùn)的CD36、肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP1)和小腸型脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP2)蛋白表達(dá)分別下降了約75%、57%和52%(P0.05),且血清游離脂肪酸水平升高了約35%(P0.05)。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,檸檬酸鐵銨處理原代小鼠肝細(xì)胞可顯著降低肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積水平(P0.05),抑制CD36和FABP1的蛋白表達(dá)(P0.05),引發(fā)細(xì)胞脂肪酸攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)障礙。6)與HFD組相比,HFD+Fe組小鼠肝臟TCA循環(huán)中的關(guān)鍵酶表達(dá)水平呈顯著性下降(P0.05),包括丙酮酸脫氫酶β、二氫硫辛酸脫氫酶、順烏頭酸酶1、線(xiàn)粒體蘋(píng)果酸脫氫酶和延胡索酸水合酶等。同時(shí),肝臟乙酰輔酶A和ATP水平在HFD+Fe組均出現(xiàn)顯著性下降,僅約為HFD組的54%和65%(P0.05)。7)HFD+Fe組小鼠肝臟出現(xiàn)一定程度氧化損傷。表現(xiàn)為亮氨酸氨基肽酶3、谷胱甘肽合成酶、谷胱甘肽過(guò)氧化酶1和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶3表達(dá)水平顯著下降(P0.05);肝臟蛋白質(zhì)發(fā)生4-HNE修飾的程度顯著增加;肝臟MDA水平較HFD組升高約34%(P0.05)而SOD和GSH水平較HFD組分別下降了約64%和31%(P0.05);肝臟細(xì)胞凋亡水平明顯增加,伴有血清AST和ALT水平較HFD組分別升高了約35%和30%(P0.05)。結(jié)論:高鐵高脂膳食喂養(yǎng)可誘發(fā)Apo E-/-小鼠系統(tǒng)鐵脂代謝紊亂,造成由CD36和FABP家族介導(dǎo)的肝臟脂肪酸攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)障礙,及以線(xiàn)粒體脂肪酸β氧化和TCA循環(huán)通路受損為主要表現(xiàn)的能量代謝障礙,而在此情況下伴發(fā)的主動(dòng)脈AS斑塊減少這一“改善假象”實(shí)為肝臟脂肪酸代謝障礙及能量不足導(dǎo)致肝臟“隱匿性損傷”加重的表現(xiàn)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R543.5
【圖文】：

圖 1.1 實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠體重變化趨勢(shì)注：與 WT 組相比，aP＜0.05；與 ND 組相比，bP＜0.052 各組實(shí)驗(yàn)小鼠 AS 斑塊形成情況評(píng)價(jià).1 小鼠主動(dòng)脈整體油紅 O 染色結(jié)果如圖 1.2 所示，WT 組小鼠主動(dòng)脈管腔內(nèi)壁光滑且基本無(wú)肉眼可見(jiàn)的紅，ND 組小鼠主動(dòng)脈弓及雙側(cè)髂動(dòng)脈分支部位血管內(nèi)壁稍顯粗糙，經(jīng)油紅可見(jiàn)少量紅染的 AS 斑塊，主動(dòng)脈其他各段未見(jiàn)明顯斑塊附著。與 WT組相比，HFD 組小鼠主動(dòng)脈弓部位以及髂動(dòng)脈分支處可見(jiàn)較大范圍的 著，且管腔其他部位亦有散在、不連續(xù)斑塊分布。利用 Image-Pro Plus 斑塊面積占主動(dòng)脈整體面積的百分比對(duì)各組小鼠主動(dòng)脈 AS 斑塊面積進(jìn)析，結(jié)果顯示：與 WT 組和 ND 組相比，HFD 組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)壁的 AS顯著增加，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖 1.2 各組小鼠主動(dòng)脈整體油紅 O 染色圖片及定量分析結(jié)果注：與 WT 組相比，aP＜0.05；與 ND 組相比，bP＜0.05；n=4。1.2.2.2 小鼠主動(dòng)脈弓橫截面 HE 染色結(jié)果如圖 1.3 所示，WT 組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑完整，管腔內(nèi)未見(jiàn)贅生物；ND 組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜可見(jiàn) 定程度增生且伴有明顯斑塊附著，斑塊內(nèi)可見(jiàn)大量泡沫細(xì)胞及無(wú)結(jié)構(gòu)狀壞死物；與 ND 組相比，HFD 組小鼠主動(dòng)脈血管結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，斑塊內(nèi)泡沫細(xì)胞聚集情況更為明顯且伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及膽固醇結(jié)晶形成。

圖 1.2 各組小鼠主動(dòng)脈整體油紅 O 染色圖片及定量分析結(jié)果注：與 WT 組相比，aP＜0.05；與 ND 組相比，bP＜0.05；n=4。1.2.2.2 小鼠主動(dòng)脈弓橫截面 HE 染色結(jié)果如圖 1.3 所示，WT 組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑完整，管腔內(nèi)未見(jiàn)贅生物；ND 組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜可見(jiàn) 定程度增生且伴有明顯斑塊附著，斑塊內(nèi)可見(jiàn)大量泡沫細(xì)胞及無(wú)結(jié)構(gòu)狀壞死物；與 ND 組相比，HFD 組小鼠主動(dòng)脈血管結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，斑塊內(nèi)泡沫細(xì)胞聚集情況更為明顯且伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及膽固醇結(jié)晶形成。

本文編號(hào)：2784065