【摘要】：第一部分腹主動脈瘤動物模型的建立及超聲圓周應(yīng)變量的應(yīng)用價值研究目的應(yīng)用血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)微泵灌注方法建立小鼠腹主動脈瘤(AAA)模型,通過超聲對整個病理過程進(jìn)行監(jiān)測,探討模型可行性以及相關(guān)特點,并評價超聲圓周應(yīng)變量的應(yīng)用價值。研究方法采用APOE~(-/-)雄性小鼠25只,給予微泵皮下植入方式建立灌注模型,其中5只為生理鹽水灌注即對照組(Con組),20只為AngⅡ灌注組(AngⅡ組)。所有小鼠于術(shù)前1天(D0),術(shù)后3天(D3),術(shù)后1周(D7),術(shù)后2周(D14)及術(shù)后4周(D28)進(jìn)行超聲監(jiān)測;D28時按正常小鼠動脈150%為成瘤標(biāo)準(zhǔn),將AngⅡ組分為成瘤(AngⅡ+AAA)及未成瘤(AngⅡ+NoAAA)組。除應(yīng)用B-mode(brightness mode)測量主動脈直徑和形態(tài)外,并在M-mode(motion mode)下測量收縮及舒張期動脈直徑(D_S,D_D)以計算圓周應(yīng)變量,應(yīng)用血管斑點示蹤技術(shù)觀察血管彈性運動軌跡,對比各組小鼠腹主動脈直徑變化,成瘤時間和部位等,計算成瘤率、死亡率及圓周應(yīng)變量等;在微泵植入術(shù)后4周進(jìn)行主動脈取材進(jìn)行切片分析。研究結(jié)果研究終點時Con組的存活率100%,成瘤率為0%;AngⅡ組成活率80%,成瘤率62.5%,并且腹主動脈最大直徑均值顯著高于Con組。AngⅡ組主動脈直徑呈現(xiàn)增大趨勢,在D7時最大直徑較前顯著增大,同時D28與D14相比血管最大直徑顯著增大,但成瘤率不變;圓周應(yīng)變量呈逐漸下降趨勢,D3與D0相比下降明顯,但成瘤率為0%,并在D14時與Con組相比明顯下降。D28時按成瘤標(biāo)準(zhǔn)分組可以發(fā)現(xiàn)AngⅡ+AAA組圓周應(yīng)變量呈下降趨勢并在D3出現(xiàn)明顯下降,且與其它兩組差異明顯,而Con組及AngⅡ+NoAAA組整個過程中圓周應(yīng)變量改變不明顯。血管斑點示蹤同樣發(fā)現(xiàn)在D3時AngⅡ+AAA小鼠盡管血管形態(tài)及直徑無明顯改變,但隨著心動周期的血管彈性明顯下降。大體標(biāo)本可見AngⅡ+AAA組腹主動脈腎動脈上段明顯擴張,而Con組與AngⅡ+NoAAA組血管大體正常,無明顯擴張。動脈切片HE染色:AngⅡ+AAA組與其它兩組相比小鼠腹主動脈壁明顯增厚,中膜彈力纖維層中斷甚至部分消失,部分組織結(jié)構(gòu)分辨不清。研究結(jié)論應(yīng)用AngⅡ微泵灌注建立小鼠AAA模型操作簡單,成瘤率穩(wěn)定,但仍存在一定的死亡率,是種相對理想的AAA動物模型,超聲監(jiān)測操作方便,能實時動態(tài)監(jiān)測動脈瘤的發(fā)生、發(fā)展,具備良好的應(yīng)用價值,同時圓周應(yīng)變量這一生物力學(xué)指標(biāo)可能在預(yù)測動脈瘤發(fā)生、發(fā)展中具備良好的應(yīng)用價值。第二部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在主動脈瘤組織修復(fù)中的作用及機制研究研究目的應(yīng)用超聲篩選出已明確成瘤的小鼠,通過BM-MSCs經(jīng)尾靜脈注射干預(yù),來觀察BM-MSCs能否到達(dá)血管損傷處參與AAA的修復(fù)過程,以及具體的作用方式和相關(guān)機制。研究方法總28只APOE-/-雄性小鼠,5只給予生理鹽水微泵植入(Con組),另23只植入Ang Ⅱ微泵。術(shù)后2周行超聲檢查,按照正常直徑×150%為標(biāo)準(zhǔn)篩選出成瘤小鼠;共12只小鼠符合成瘤標(biāo)準(zhǔn),隨機分成Ang Ⅱ+Msc組與Ang Ⅱ組,兩組瘤體最大直徑及圓周應(yīng)變量無差異;Ang Ⅱ組給予生理鹽水經(jīng)尾靜脈注射,Ang Ⅱ+Msc組給予自帶熒光標(biāo)記BM-MSCs尾靜脈注射,植入術(shù)后4周行第2次注射,6周后行超聲檢查并處死小鼠收集標(biāo)本,應(yīng)用免疫熒光、ELISA、Western Blotting等方法檢測三組之間是否存在差異。研究結(jié)果終點時Ang Ⅱ組與Ang Ⅱ+Msc組間瘤體最大直徑無明顯差異;但Ang Ⅱ組瘤體直徑6周與2周相比明顯增大,而Ang Ⅱ+Msc組前后相比無明顯差異,同時兩組間與組內(nèi)的圓周應(yīng)變量均無明顯差異。通過熒光標(biāo)記觀察到MSCs具備向血管損傷處聚集的特性,并主要分布在內(nèi)中膜,外膜未查及;CD68+染色可見MSCs能減少巨噬細(xì)胞對血管壁的侵潤,而Ang Ⅱ+Msc組血管壁細(xì)胞凋亡率要明顯好于Ang Ⅱ組;HE染色和EVG染色可見Con組血管管腔正常,中膜彈力纖維層完好,Ang Ⅱ組與Ang Ⅱ+Msc組中膜彈力纖維層均有不同程度的破壞但Ang Ⅱ+Msc組在血管腔面有較完整連續(xù)細(xì)胞排列結(jié)構(gòu),中膜仍可見較多彈力蛋白染色陽性纖維呈層狀排列,而Ang Ⅱ組存在明顯附壁血栓形成;CD31染色可見MSCs具備向內(nèi)皮樣細(xì)胞分化的能力,同時Ang Ⅱ+Msc組在血管腔面存在連續(xù)排列的CD31+細(xì)胞;應(yīng)用α-SMA/OPN免疫組化染色可見Con組彈力纖維層中VSMC以α-SMA染色為主,OPN幾乎無表達(dá),Ang Ⅱ+Msc組VSMC仍以梭形形態(tài)為主,α-SMA+染色較多,但Ang Ⅱ組VSMC以圓形或三角形形態(tài)為主,OPN+染色較多;同時彈力纖維層結(jié)構(gòu)已消失的中膜,Ang Ⅱ+Msc組仍可見層狀排列纖維存在,纖維間部分細(xì)胞呈梭形形態(tài),并呈α-SMA+染色,而Ang Ⅱ組很少類似纖維存在,細(xì)胞形態(tài)大多為圓形或三角形,α-SMA+細(xì)胞很少;免疫熒光檢測可見MSCs能表達(dá)胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及血小板衍生因子-B(PDGF-B);ELISA檢測相關(guān)炎癥因子可以發(fā)現(xiàn)MSCs干預(yù)能減少動脈瘤組織中IL-6,MCP-1及TNF-α的含量;最后Western Blotting檢測提示Ang Ⅱ+Msc組相對Ang Ⅱ組的MMP-2、MMP-9表達(dá)更少,同時Ang Ⅱ組與Ang Ⅱ+Msc組的α-SMA的表達(dá)水平下降,盡管Ang Ⅱ+Msc組高于Ang Ⅱ組,但差異并不明顯,而OPN在Con組幾乎不表達(dá),Ang Ⅱ+Msc組的OPN表達(dá)水平明顯低于Ang Ⅱ組。研究結(jié)論MSCs對于已成瘤的AAA發(fā)展同樣起到抑制作用,這種作用除了能減輕血管壁的炎癥細(xì)胞侵潤、抑制相關(guān)炎癥因子和MMPs的活性、減少VSMC的凋亡、分泌相關(guān)生長因子等外,還能通過在促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞層的修復(fù),減少附壁血栓的發(fā)生,并調(diào)控VSMC過度去分化,進(jìn)而維持VSMC的功能與數(shù)量的平衡等方面起到重要的作用,通過上述作用共同達(dá)到抑制AAA的進(jìn)一步發(fā)展的作用。第三部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞調(diào)控平滑肌細(xì)胞表型的驗證及可能機制研究目的通過細(xì)胞共培養(yǎng)的方式,驗證MSCs對VSMC的凋亡和表型的調(diào)控作用,并探討Notch通道在表型調(diào)控中的作用。研究方法應(yīng)用單獨VSMC培養(yǎng)、MSCs與VSMC直接混合及Transwell間接混合培養(yǎng),計為VSMC、VSMC-MSC、Tra-VSMC-MSC組,通過免疫熒光和Western Blotting等方法來進(jìn)行相關(guān)檢測,比較組間的差異。研究結(jié)果VSMC-MSC組中的α-SMA+VSMC細(xì)胞占比多于VSMC組,組間差異明顯;VSMC組中的OPN+VSMC細(xì)胞占比多于VSMC-MSC組且組間差異明顯;Tra-VSMC-MSC組與VSMC組組間無明顯差異。200um的H_2O_2刺激24小時后VSMC-MSC組中VSMC的凋亡率低于VSMC組;Tra-VMSC-MSC組凋亡率低于VSMC組;而VSMC-MSC組與Tra-VMSC-MSC組組間無差異。VSMC-MSC組的NICD+VSMC占比高于VSMC組。同等數(shù)量的VSMC和MSC行Western Blotting檢測:MSCs相對VSMC能夠表達(dá)更多的Jagged-1。研究結(jié)論MSCs除了可以抑制VSMC凋亡外,還可以通過直接接觸來調(diào)控VSMC的表型轉(zhuǎn)化,并且Jagged-1-Notch通道可能在其中起到重要作用,這個可能是MSCs抑制AAA發(fā)生、發(fā)展的機制之一;病理過程中VSMC的增殖、表型以及功能改變,是一個復(fù)雜的過程,三者之間互有聯(lián)系,又存在區(qū)別,而維持VSMC結(jié)構(gòu)和功能的平衡可能顯得意義更為重大;Notch通道的激活在AAA中作用可能是把雙刃劍,其可能在加重炎癥反應(yīng)方面促進(jìn)AAA的發(fā)生,而在調(diào)控VSMC的表型、抗凋亡、維持VSMC的數(shù)量和功能平衡等方面可能起到抑制AAA的作用,而這些作用可能與整個血管壁的微環(huán)境有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R543.16
【圖文】：

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在腹主動脈瘤組織修復(fù)中的作用及機制研究主動脈瘤成瘤率為 0%，腹主動脈直徑(1.072±0.119mm);AngII 組小鼠 20 只，最終成活率 80%，腹主動脈瘤成瘤率 62.5%，腹主動脈直徑（1.682±0.620mm)，在 D28 時候AngII 組顯著高于 Con 組（1.682±0.620mm vs 1.072±0.119mm P=0.037）。

Con組小鼠主動脈縱切面測量圖像

Con組小鼠主動脈橫切面測量圖像

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本文編號：2780693