【摘要】：研究目的:TMEM16A/Anoctamin-1(ANO1)是新發(fā)現(xiàn)的鈣激活氯通道(calcium-activated chloride channel,CaCC),在心血管組織有廣泛的表達(dá)。在自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR),ANO1在血管組織和原代培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)表達(dá)明顯增強(qiáng),并參與血管功能和血壓的調(diào)控。我們的前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):ANO1特異性抑制劑T16A(inh)-A01(A01)處理SHR-VSMC一天后,細(xì)胞增殖和遷移均被抑制。在此基礎(chǔ)上,本研究進(jìn)一步觀察了ANO1抑制劑(A01)對(duì)VSMC增殖的抑制作用,并探討了相關(guān)信號(hào)通路的變化。研究?jī)?nèi)容和方法:1.利用Western blot法檢測(cè)SHR-VSMC上ANO1表達(dá)的變化。2.將ANO1抑制劑A01分別加入SHR-VSMC和WKY-VSMC處理24h或72h,通過MTT法觀察A01對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。3.將A01分別加入SHR-VSMC和WKY-VSMC處理24h,觀察它對(duì)細(xì)胞增殖核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)蛋白水平的影響。4.利用PI(碘化丙錠)染色法,觀察A01對(duì)VSMC細(xì)胞周期的影響。5.將A01加入SHR-VSMC和WKY-VSMC,觀察A01對(duì)Erk通路的影響。6.將A01加入SHR-VSMC和WKY-VSMC,觀察A01對(duì)Akt通路的影響。7.利用激光共聚焦顯微鏡及鈣離子熒光染料,觀察A01對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣水平的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.與WKY-VSMC相比,SHR-VSMC ANO1蛋白水平顯著升高(P0.01)。2.MTT結(jié)果顯示:與WKY-VSMC對(duì)照組相比,SHR-VSMC的活細(xì)胞數(shù)目明顯增多,生長(zhǎng)速度明顯加快(P0.01)。與SHR-VSMC對(duì)照組相比,1-5μM A01處理24h對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用不明顯,但是10-20μM A01導(dǎo)致細(xì)胞的活細(xì)胞數(shù)目減少(P0.05)。A01(5-20μM)作用72h后,A01抑制細(xì)胞增殖的效應(yīng)更加明顯(P0.01)。A01作用24h和72h對(duì)WKY-VSMC的增殖均無(wú)明顯影響。3.與WKY-VSMC相比,SHR-VSMC的PCNA表達(dá)顯著升高(P0.01)。A01(20μM)處理24h可部分抑制SHR-VSMC上PCNA的高表達(dá)(P0.05)。4.利用流式細(xì)胞儀和PI染色發(fā)現(xiàn):與WKY-VSMC相比,SHR-VSMC出現(xiàn)G_1期比例下降的趨勢(shì),S期比例明顯升高(P0.05)。A01(20μM)處理24h可導(dǎo)致SHR-VSMC的S期比例下降(P0.05)。但是在WKY-VSMC,A01的抑制作用并不明顯。5.通過檢測(cè)Erk蛋白發(fā)現(xiàn):WKY-VSMC加入A01(20μM)作用5-60min,p-Erk表達(dá)有所下降但是沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在SHR-VSMC,20μM A01可明顯抑制Erk的激活,最大效應(yīng)出現(xiàn)在加藥后30-60min(P0.01)。當(dāng)以不同濃度A01(1-20μM)處理WKY-VSMC 30min,p-Erk的表達(dá)并無(wú)明顯改變,而10-20μM A01加入SHR-VSMC后,顯著抑制了p-Erk的表達(dá)(P0.01)。以上結(jié)果提示A01抑制SHR-VSMC的Erk信號(hào)通路具有時(shí)間和劑量依賴性。6.通過檢測(cè)Akt蛋白發(fā)現(xiàn):20μM A01加入SHR-VSMC處理5-60min,p-Akt的表達(dá)無(wú)明顯變化。不同濃度A01加入SHR-VSMC孵育30min,p-Akt水平和對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。不同于Erk信號(hào)通路,Akt通路可能不參與A01對(duì)SHR-VSMC增殖的抑制作用。7.利用激光共聚焦顯微鏡觀察胞內(nèi)Ca~(2+)的熒光成像。結(jié)果顯示:與WKY-VSMC相比,SHR-VSMC可記錄到更加強(qiáng)的Ca~(2+)熒光信號(hào),而加入A01(20μM)后連續(xù)掃描2min,SHR-VSMC胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度明顯降低(P0.05)但仍高于WKY-VSMC,提示A01能部分拮抗SHR-VSMC胞內(nèi)鈣的異常升高。結(jié)論:綜上所述,ANO1抑制劑能明顯抑制SHR-VSMC的異常增殖,該抑制作用可能與減少細(xì)胞周期中S期細(xì)胞比例,抑制Erk信號(hào)通路的激活以及降低胞內(nèi)鈣水平密切相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R544.11
【圖文】：

圖 1 血管平滑肌細(xì)胞 ANO1 的表達(dá)Fig.1 Protein levels ofANO1 in VSMCultured SHR-VSMC and WKY-VSMC were used in this experdetected by western blot analysis after 24 hours of adherent ce ratio of target proteins to β-actin.**P<0.01 compared with the

圖 2 A01 處理 24h 和 72h 對(duì)細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect ofA01 treatment on cell proliferationMC and WKY-VSMC were treated with different concentrations of A01(1, 5, 72h (B). The cell proliferation was detected by the MTT assay.##P<0.01 comcontrol,*P<0.05 compared with SHR-VSMC control,**P<0.01 compontrol, n=5.

圖 3 A01 對(duì)血管平滑肌細(xì)胞 PCNA 表達(dá)的影響Fig.3 Effect ofA01 on PCNA expression in VSMC) were incubated with the cells for 24h, then PCNA levels were dete<0.01 compared with the WKY-VSMC,*P<0.05 compared with the SH抑制劑 A01 對(duì)細(xì)胞周期的影響

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2774798