發(fā)布時(shí)間：2020-07-30 03:40

【摘要】：背景炎癥狀態(tài)和內(nèi)皮功能紊亂是動(dòng)脈粥樣硬化的啟動(dòng)因素。冠心病患者的心外膜脂肪組織多為白色脂肪組織,包饒?jiān)诠跔顒?dòng)脈周?chē)?可通過(guò)分泌炎癥脂肪因子影響內(nèi)皮功能,在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。血管擴(kuò)張刺激磷蛋白(vasodilator stimulated phosphoprotein,VASP)是一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白,在與細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)相關(guān)的各種細(xì)胞行為中發(fā)揮著重要作用。目的探討VASP是否可以通過(guò)改變細(xì)胞骨架極性調(diào)節(jié)心外膜脂肪細(xì)胞棕色和白色表型之間的轉(zhuǎn)換,及其對(duì)脂肪因子抵抗素促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移功能的影響。方法:第一部分(1)取南京總醫(yī)院行瓣膜置換術(shù)的非冠心病患者的心外膜脂肪組織離體培養(yǎng),并誘導(dǎo)分化為成熟棕色脂肪細(xì)胞,觀察細(xì)胞形態(tài)及油紅染色觀察成脂情況。(2)用同一濃度的IL-6(100ng/ml)作用成熟脂肪細(xì)胞,通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)棕色脂肪基因(UCP-1,PRDM16)與白色脂肪基因(resistin,RIP140)表達(dá)水平。(3)利用RNA干擾技術(shù),在成熟棕色脂肪細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照載體LV-control siRNA(LV-sicntr)和慢病毒表達(dá)載體LV-VASPsiRNA(LV-siVASP)后,RT-PCR法和蛋白免疫印跡法檢測(cè)兩組細(xì)胞VASP表達(dá),并利用免疫熒光雙重染色觀察肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)。(4)成熟棕色脂肪細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染LV-control siRNA(LV-sicntr)和LV-VASPsiRNA(LV-siVASP)后,通過(guò)RT-PCR的方法檢測(cè)LV-sicntr和 LV-siVASP兩組UCP-1,PRDM16與resistin,RIP140表達(dá)變化。(5)RT-PCR的方法檢測(cè)檢測(cè)在LV-sicntr和LV-siVASP兩組炎癥因子IL-6,IL-8,MCP-1,TNF-α 的表達(dá)。(6)采用VASP基因敲除的脂肪細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)組加入RhoA/ROCK抑制劑Y-27632抑制ROCK活性,RT-PCR的方法檢測(cè)UCP-1,PRDM16與resistin,RIP140表達(dá)水平;并檢測(cè)炎癥因子IL-6,IL-8,MCP-1,TNF-α的表達(dá)。第二部分(1)不同濃度的抵抗素(Ong/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml)體外作用于人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞系(HCAECs),MTT法檢測(cè)抵抗素對(duì)細(xì)胞增殖的作用,Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的改變。(2)構(gòu)建針對(duì)人VASP的慢病毒表達(dá)載體(LV-siVASP)和陰性對(duì)照載體(LV-sicntr),并將其感染HCAECs,RT-PCR檢測(cè)VASPmRNA的表達(dá),Western blot測(cè)定蛋白的表達(dá)。在相同抵抗素濃度(100ng/ml)下,檢測(cè)LV-sicntr組、LV-sicntr+resistin組和LV-siVASP組+LV-siVASP+resistin組對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移影響。(3)免疫熒光法分析LV-sicntr和LV-siVASP組細(xì)胞表面受體血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR2)表達(dá)情況。結(jié)果第一部分:(1)人心外膜原代前脂肪細(xì)胞大多數(shù)呈梭形改變,誘導(dǎo)分化12-20天后可見(jiàn)80%以上細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大小不等的多脂滴脂肪細(xì)胞。油紅0染色后棕色脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴被染成紅色。(2)RT-PCR結(jié)果表明:在同一濃度的IL-6(100 ng/ml)下,棕色表型基因UCP-1,PRDM16表達(dá)量逐漸減少,白色表型基因resistin,RIP140表達(dá)量逐漸增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3)轉(zhuǎn)染慢病毒48h后,RNA表達(dá)抑制率為68.1%,VASP蛋白表達(dá)抑制率為59.3%,與LV-sicntr陰性對(duì)照組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。成熟脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)染VASP-shRNA質(zhì)粒48h后,轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組相比,規(guī)律成束的長(zhǎng)應(yīng)力纖維減少,大多數(shù)為凌亂的短纖維。(4)RT-PCR結(jié)果表明:與LV-sicntr陰性對(duì)照組比較,LV-siVASP組UCP-1,PRDM16表達(dá)量逐漸減少,resistin,RIP140表達(dá)量逐漸增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。而且,與LV-sicntr陰性對(duì)照組比較,LV-siVASP組炎癥因子IL-6,IL-8,MCP-1,TNF-α的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(6)在VASP敲除脂肪細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)組加入RhoA/ROCK抑制劑Y-27632后,RT-PCR方法檢測(cè)顯示,與LV-siVASP組比較,實(shí)驗(yàn)組炎癥因子IL-6,IL-8,MCP-1,TNF-α的表達(dá)明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。此外,與LV-siVASP組比較,實(shí)驗(yàn)組UCP-1,PRDM16表達(dá)增加,resistin,RIP140表達(dá)減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。第二部分(1)與對(duì)照組相比,50-200ng/ml抵抗素作用48h或12h后,呈劑量依賴(lài)性的促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移(P0.05);(2)與轉(zhuǎn)染LV-sicntr陰性對(duì)照組相比,LV-siVASP組VASP表達(dá)在基因與蛋白水平均明顯下降(P0.05);(3)與轉(zhuǎn)染LV-sicntr+resistin組相比,LV-siVASP組+resistin細(xì)胞的增殖、遷移能力明顯減弱(P0.05)(4)LV-s i cntr組和LV-s i VASP組血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR2)表達(dá)情況未見(jiàn)明顯差異。結(jié)論第一部分(1)在成熟棕色脂肪細(xì)胞,沉默基因VASP后,促進(jìn)脂肪細(xì)胞棕色到白色轉(zhuǎn)化,且炎癥因子的表達(dá)增加,表明炎癥因子在敲除VASP后參與的脂肪細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換中發(fā)揮了重要作用。(2)在VASP敲除棕色脂肪細(xì)胞,抑制RhoA/ROCK活性,炎癥因子的表達(dá)減少,抑制了棕色到白色脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化,表明敲除脂肪細(xì)胞VASP后的表型轉(zhuǎn)換可能與RhoA/ROCK活性有關(guān)。第二部分(1)抵抗素呈濃度依賴(lài)性的促進(jìn)冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移。(2)抵抗素可通過(guò)VASP信號(hào)分子促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移。(3)VASP對(duì)抵抗素功能的影響與VEGFR2表達(dá)無(wú)關(guān)�？傉�:VASP參與心外膜脂肪細(xì)胞棕色和白色之間的轉(zhuǎn)換,可能RhoA/ROCK介導(dǎo)的炎癥因子的表達(dá)有關(guān),且VASP在抵抗素促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移功能中發(fā)揮重要作用。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R541.4
【圖文】：

圖１邋（Ａ）人心外膜前脂肪細(xì)胞的形態(tài)（Ｂ）人心外膜成熟脂肪細(xì)胞的形態(tài)逡逑（Ｃ）油紅０染色后的脂肪細(xì)胞逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１邐（Ａ）邋Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ｈｕｍａｎ邋ｐｒｉｍａｒｙ邋ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ邋（Ｂ）邋Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ｈｍａｔｕｒｅ邋ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ邋（Ｃ）邋Ｈｕｍａｎ邋ｍａｔｕｒｅ邋ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ邋ａｆｔｅｒ邋Ｏｉｌ邋Ｒｅｄ邋Ｏ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ逡逑

膜脂肪細(xì)胞較對(duì)照組（ＬＶ－ｓｉｃｎｔｒ）的ＶＡＳＰ的基因和蛋白表達(dá)明顯減少（圖３）。逡逑Ｅｎａ／ＶＡＳＰ家族促進(jìn)肌動(dòng)蛋白纖維的形成，對(duì)照組為長(zhǎng)且有規(guī)律的肌動(dòng)蛋白纖逡逑維，沉默ＶＡＳＰ后可見(jiàn)短且零亂的肌動(dòng)蛋白形成（圖４邋Ａ）。在ＶＡＳＰ沉默成功后，逡逑我們繼續(xù)研宄了ＶＡＳＰ對(duì)心外膜脂肪細(xì)胞表型的影響。ＲＴ－ＰＣＲ檢查結(jié)果提示：逡逑ＬＶ－ｓ邋ｉＶＡＳＰ組成熟心外膜脂肪細(xì)胞內(nèi)ＵＣＰ－ｌ，邋ＰＲＤＭ１６基因表達(dá)逐漸減少，逡逑ｒｅｓｉｓｔｉｎ，ＲＩＰ１４０基因表達(dá)逐漸增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖４Ｂ，邋Ｐ〈０．邋０５），逡逑表明沉默ＶＡＳＰ促進(jìn)棕色脂肪細(xì)胞白色化。接著我們進(jìn)一步檢測(cè)了在白介素－６逡逑（１００邋ｎｇ／ｍｌ）作用下ＶＡＳＰ的表達(dá)，結(jié)果示ＶＡＳＰ表達(dá)較對(duì)照組明顯的減少（圖逡逑２Ｂ）。逡逑１０逡逑

在研究ＶＡＳＰ對(duì)心外膜脂肪細(xì)胞表型的影響前，首先我們進(jìn)行小干擾ＲＮＡ逡逑技術(shù)沉默心外膜脂肪細(xì)胞ＶＡＳＰ。ＲＴ－ＰＣＲ及ＷＢ技術(shù)提示：ＬＶ－ｓｉＶＡＳＰ組成熟心外逡逑膜脂肪細(xì)胞較對(duì)照組（ＬＶ－ｓｉｃｎｔｒ）的ＶＡＳＰ的基因和蛋白表達(dá)明顯減少（圖３）。逡逑Ｅｎａ／ＶＡＳＰ家族促進(jìn)肌動(dòng)蛋白纖維的形成，對(duì)照組為長(zhǎng)且有規(guī)律的肌動(dòng)蛋白纖逡逑維，沉默ＶＡＳＰ后可見(jiàn)短且零亂的肌動(dòng)蛋白形成（圖４邋Ａ）。在ＶＡＳＰ沉默成功后，逡逑我們繼續(xù)研宄了ＶＡＳＰ對(duì)心外膜脂肪細(xì)胞表型的影響。ＲＴ－ＰＣＲ檢查結(jié)果提示：逡逑ＬＶ－ｓ邋ｉＶＡＳＰ組成熟心外膜脂肪細(xì)胞內(nèi)ＵＣＰ－ｌ，邋ＰＲＤＭ１６基因表達(dá)逐漸減少，逡逑ｒｅｓｉｓｔｉｎ，ＲＩＰ１４０基因表達(dá)逐漸增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖４Ｂ，邋Ｐ〈０．邋０５），逡逑表明沉默ＶＡＳＰ促進(jìn)棕色脂肪細(xì)胞白色化。接著我們進(jìn)一步檢測(cè)了在白介素－６逡逑（１００邋ｎｇ／ｍｌ）作用下ＶＡＳＰ的表達(dá)，結(jié)果示ＶＡＳＰ表達(dá)較對(duì)照組明顯的減少（圖逡逑２Ｂ）。逡逑１０逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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1 倪鳴;王金焱;王t

本文編號(hào)：2774958