【摘要】：目的:探究大鼠H9C2心肌細(xì)胞在缺氧復(fù)氧過程中Beclin-1是否被Caspase-3剪切,以及抑制Beclin-1的剪切對(duì)H9c2細(xì)胞缺氧復(fù)氧后自噬、凋亡和壞死的影響。方法:本研究用大鼠H9c2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧作為模型,觀察復(fù)氧過程中Beclin-1及其剪切體的蛋白表達(dá);將H9c2心肌細(xì)胞用Caspase-3抑制劑(Ac-DEVD-CHO)預(yù)處理后(Caspase-3 Inhibition,Cp3I),再進(jìn)行缺氧5小時(shí)后復(fù)氧2小時(shí)(hypoxia 5 hours reoxygenation 2 hours,H5R2)處理。比較Cp3I+H5R2組、H5R2組、Cp3I組和假手術(shù)組的Beclin-1及其剪切體的蛋白表達(dá);同時(shí)根據(jù)氨基酸序列比對(duì),將Beclin-1在147號(hào)易被Caspase-3剪切的天冬氨酸突變?yōu)楣劝彼?并分別將突變型Beclin-1(M-Beclin-1)和未突變型Beclin-1(W-Beclin-1)轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞中,再比較缺氧5小時(shí)復(fù)氧2小時(shí)后兩組Beclin-1及其剪切體的表達(dá)和分布;最后運(yùn)用流式細(xì)胞儀來(lái)檢測(cè)M-Beclin-1組和W-Beclin-1組在缺氧5小時(shí)后的復(fù)氧過程中,細(xì)胞自噬、凋亡和壞死水平的變化。結(jié)果:在大鼠H9c2心肌細(xì)胞缺氧5小時(shí)后復(fù)氧的過程中,Western Blot上出現(xiàn)了Beclin-1剪切體的印記;Cp3I+H5R2組中Beclin-1的剪切體數(shù)目少于H5R2組(p0.001);M-Beclin-1組在細(xì)胞缺氧5小時(shí)復(fù)氧2小時(shí)后,Beclin-1被剪切現(xiàn)象明顯少于W-Beclin-1組(p0.05);在細(xì)胞中分別過表達(dá)未突變型和突變型的Beclin-1后,兩組細(xì)胞隨著復(fù)氧時(shí)間的推移,細(xì)胞自噬水平先增加后減少,但突變組的自噬程度高于同時(shí)期的未突變組。過表達(dá)未突變型的細(xì)胞隨著復(fù)氧時(shí)間的推移,凋亡的細(xì)胞和壞死的細(xì)胞不斷增多;過表達(dá)突變型的細(xì)胞隨著復(fù)氧時(shí)間的推移,細(xì)胞的凋亡和壞死均維持在低水平。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)方法和條件下得出的結(jié)論如下:在大鼠H9c2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧的過程中,存在著Beclin-1被Caspase-3剪切的現(xiàn)象,且抑制Beclin-1剪切,可以提高復(fù)氧后的細(xì)胞的自噬水平,降低細(xì)胞凋亡和壞死的水平,為臨床上治療缺血性心肌病提供新的思路。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R54
【圖文】：

圖 2.3.2.1 實(shí)驗(yàn)分組Fig. 2.3.2.1 Experimental grouping缺氧 5h 復(fù)氧 0h（H5R0 組）：H9c2 細(xì)胞用缺氧液先在 37℃、95%N2、5%CO2中培養(yǎng) 5 小時(shí)后，取出細(xì)胞。缺氧 5h 復(fù)氧 1h（H5R1 組）：H9c2 細(xì)胞用缺氧液先在 37℃、95%N2、5%CO2中培

0.05)；隨著復(fù)氧的時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，復(fù)氧 2 小時(shí)后 50kDa 處的剪切體的表達(dá)明顯高于復(fù)1 小時(shí)后(p< 0.05)，復(fù)氧 3 小時(shí)后 50kDa 處的剪切體的表達(dá)明顯高于復(fù)氧 2 小時(shí)后0.05)。2.3.2 在 H9c2 缺氧復(fù)氧過程中 Beclin-1 被剪切和 Caspase-3 的活性相關(guān)2.3.2.1 實(shí)驗(yàn)分組對(duì)照組（Control 組）：H9c2 細(xì)胞用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于 37℃、95%空氣、5%CO2連續(xù)培養(yǎng)。缺氧復(fù)氧組（H/R 組）：H9c2 細(xì)胞用缺氧液先在 37℃、95%N2、5%CO2中培養(yǎng)小時(shí)后，再用復(fù)氧液置換缺氧液，將細(xì)胞在 37℃、95%空氣、5%CO2中培養(yǎng) 2h。Caspase-3 抑制組（Cp3I 組）：將 Caspase-3 抑制劑處理后的 H9c2 細(xì)胞用完全培養(yǎng)基養(yǎng)于 37℃、95%空氣、5%CO2中，連續(xù)培養(yǎng)。Caspase-3 抑制后缺氧復(fù)氧組（Cp3I+H/R 組）：將 Caspase-3 抑制劑處理后的 H細(xì)胞用缺氧液先在 37℃、95%N2、5%CO2中培養(yǎng) 5 小時(shí)后，再用復(fù)氧液置換缺氧液將細(xì)胞在 37℃、95%空氣、5%CO2中培養(yǎng) 2h。

a)抑制 Caspase-3 后 Beclin-1 及其剪切體在復(fù)氧 2 小時(shí)的表達(dá). *** p <0統(tǒng)計(jì)( x±SD)。(a) The expression of Beclin-1 and its fragments after reoxygenation for 2h afCaspase-3. ***p< 0.001. (b) Data statistics( x±SD).t結(jié)果顯示，和對(duì)照組相比，H/R組Beclin-1剪切體的表達(dá)明顯增R 組相比，H/R 組 Beclin-1 剪切體的表達(dá)也明顯增多（p<0.001）結(jié)究?jī)?nèi)容包括： H9c2 心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧過程中，Beclin-1 被剪切；制作 H9c2 復(fù)氧的 time course，挑選了復(fù)氧過程中 Beclin-1 被剪復(fù)氧后第 2 小時(shí)。為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了檢測(cè) Beclin-1 剪切程度的時(shí)間越長(zhǎng)，Beclin-1 剪切體的表達(dá)越多； Caspase-3 可減少 Beclin-1 的剪切。

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本文編號(hào)：2773912