【摘要】：第一部分實驗性房顫心房肌mRNA轉錄組表達譜分析房顫大鼠模型。并于手術前和手術10天后分別行心臟電生理檢查,包括AERP和房顫誘發(fā)性。研究背景心房顫動(房顫,AF)是最常見的快速性心房電活動紊亂,其發(fā)病率高且隨著年齡的增長而倍增(85歲時達到7.1%),預計未來25年內房顫患者將增加2倍。心房電活動紊亂導致的血栓栓塞并發(fā)癥,會給患者造成極高的致殘率與致死率,因此房顫嚴重威脅患者的生命健康,降低患者的生活質量。雖經多年努力,但房顫的治療效果仍不令人滿意,這與其復雜的發(fā)生機制仍不為我們熟知相關。經過多年研究,人們認識到心房重構是房顫發(fā)生和維持的重要機制,其主要包括電重構、結構重構、自主神經重構。心房重構的分子機制研究及能否尋找到新的分子干預靶點來治療和預防房顫是人們關注的焦點。執(zhí)行各種生命活動的生物蛋白分子,源于遺傳密碼的精確調控。核酸分子的遺傳調控遠比人類的想象復雜的多,基因組研究和基因表達調控研究為疾病的發(fā)生和轉歸機理開辟了新篇章。研究目的本研究擬探究房顫重構后心房肌mRNA轉錄組表達譜的變化,確定顯著差異表達的基因,并通過生物信息學分析方法篩選在房顫重構通路中發(fā)揮重要作用的關鍵分子,為房顫心房重構發(fā)生的分子機制提供新闡釋,為房顫的優(yōu)化治療提供潛在的靶點。材料與方法1.實驗性房顫模型的建立選取20只健康雄性Wistar大鼠,體重在240-260 g,隨機分為對照組(n=10)和實驗性房顫組(n=10),兩組均行手術將小動物起搏電極置于右心房,對照組不予起搏,喂養(yǎng)10天,房顫組以15 Hz(900次/分)起搏10天建立實驗性2.電生理指標檢測起搏結束后,從右側頸靜脈插入標測電極送入右心房,測定心房有效不應期(AERP)和房顫誘發(fā)率。未能成功誘導心房激動的最長S1S2間期為AERP。超速電刺激(20-25 Hz)短陣施放以誘發(fā)房顫,房顫的成功誘發(fā)定義為快速不規(guī)則的心房節(jié)律持續(xù)l0s。然后,留取心房組織凍存?zhèn)溆谩?.轉錄組的測序分析并驗證應用Trizol法提取對照組及房顫組各3只大鼠左心房的總RNAs,通過測序分析檢測mRNAs轉錄本的差異表達。并隨機選取部分mRNAs轉錄本,應用實時定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)的方法,對測序結果進行驗證。4.生物信息學分析對存在差異表達的mRNAs行Gene Ontology(GO)富集分析及Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路分析�；诓町惐磉_基因的KEGG分析,將通路中的分子構建樹形網絡,尋找通路間交叉的關鍵分子。結果1.通過右心房快速起搏成功建立房顫大鼠模型。與對照組相比,房顫組AERP顯著縮短,房顫誘發(fā)率增高。2.通過房顫與非房顫大鼠左心房組織的測序分析,同時滿足表達量變化(Fold Change)≥2倍且p0.05的mRNA轉錄本共有956個;其中395個轉錄本表達下調,561個轉錄本表達上調。隨機選取6個mRNAs轉錄本行qRT-PCR,其表達趨勢與測序結果一致,證實測序結果可靠。3.GO富集分析推測差異表達的mRNAs涉及到細胞增殖、細胞黏附、蛋白質水解等生物學過程;KEGG通路分析表明差異表達的mRNAs與細胞外基質構建、黏附分子通路及肥厚型心肌病等相關的生物學通路密切相關。根據構建的通路分子級聯網絡,篩選出IGF1、CACNB4、ADCY5、ITGA4等通路交叉點,這些分子可能通過多通路發(fā)揮多種生物學關鍵作用。我們選取IGF1作為房顫重構發(fā)生機制研究的關鍵分子,行進一步探究。結論在房顫/非房顫大鼠左心房內mRNAs轉錄本存在顯著差異性表達,這些差異表達的轉錄本與房顫心房重構密切相關。第二部分IGF1在心房顫動大鼠心房肌纖維化中的作用研究背景心房顫動(簡稱房顫)是心房電活動的紊亂,是最常見的快速型心律失常之一,嚴重影響著患者的身心健康和生活質量。盡管針對房顫的治療取得了諸多進展,但房顫的治療效果依然不甚理想,這與其發(fā)生機制仍不十分明了有密切關系。結構重構,電重構,自主神經重構在房顫的發(fā)生與維持中發(fā)揮重要作用。其中結構重構是房顫維持和復發(fā)的關鍵因素。心房結構重構主要表現為顯著的心房間質纖維化,且房顫的發(fā)生隨心房纖維化程度的增加而增加。心房間質纖維化可干擾心房局部的激動傳導,造成單向傳導減慢或阻滯,增加房顫發(fā)生的可能性。徹底治療房顫是21世紀心血管領域的主戰(zhàn)場:是否還有更深入的機制來闡釋房顫的發(fā)生和維持?是否還有其他干預靶點來預防和治療房顫?IGF1是一類具有胰島素樣代謝效應的因子,可以促進細胞生長、抑制細胞凋亡;IGF1主要在肝臟合成分泌,骨骼肌、心臟亦可合成肌肉特異性IGF1(mIGF1),通過內分泌、旁分泌等形式調控下游途徑;IGF1參與到細胞的增殖、分化、凋亡以及機體代謝、胚胎發(fā)育、蛋白沉積與分解等過程中。研究表明,IGF-1作用于相應受體后,其激活的信號途徑主要是兩條:通過激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)和絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)等信號通路發(fā)揮作用。且研究顯示,IGF-1是一類強致纖維化因子,能夠上調細胞外基質蛋白的表達。研究目的本研究擬探究IGF1因子對房顫大鼠心房肌纖維化的影響,揭示IGF1致纖維化的作用機制和途徑,為房顫心房重構發(fā)生的分子機制提供新闡釋,為房顫的優(yōu)化治療提供潛在的靶點。材料與方法1.體外心房成纖維細胞IGF1干擾實驗及細胞活力檢測體外提取大鼠心房組織成纖維細胞培養(yǎng),傳代至3-4代時行質粒轉染實驗。將細胞隨機分為陰性對照組,mIGF1過表達組,mIGF1沉默組。培養(yǎng)48 h后提取RNA,72 h后提取蛋白。并應用CCK8試劑盒檢測質粒轉染后的細胞活力。2.在體感染AAV9型腺相關病毒體外構建AAV9型mIGF1沉默腺相關病毒。選取30只健康雄性Wistar大鼠,體重在240-260 g,隨機分為陰性對照組(n= 10),植入起搏對照裝置,尾靜脈注射陰性對照腺相關病毒;起搏組(n=10),行右心房快速起搏(15 Hz),尾靜脈注射陰性對照腺相關病毒;起搏+mIGF1沉默病毒組(n=10),行右心房快速起搏(15 Hz),尾靜脈注射mIGF1沉默干擾腺相關病毒。起搏電極植入方法同第一部分。手術后通過尾靜脈注射1 × 10E11 TU的腺相關病毒。于起搏10天后停止起搏。病毒注射14天后處死動物,取心房組織凍存行下一步實驗。3.AERP的檢測及房顫誘發(fā)手術前及動物處死前,應用多通道程序刺激儀分別對陰性對照組、起搏組、起搏+mIGF1沉默病毒組行電生理檢查,測定AERP和房顫誘發(fā)性。4.分子生物學指標的檢測Trizol法提取感染后組織和轉染后細胞的總RNAs,qRT-PCR方法檢測IGF1、CTGF、AT1R、COL1A1、COL3A1 的表達量;應用 Western Blotting 方法測定IGF1、CTGF、AT1R、p/t-PI3K、p/t-Akt、Bcl2、Bax等基因蛋白的表達水平。5.免疫組化及Masson染色對CTGF、TGF-β1等指標行免疫組化染色,測定陽性指標表達量;對組織切片行Masson染色,鑒定纖維化程度。結果1.對于心房成纖維細胞行mIGF1基因表達干擾,與陰性對照組比較,mIGF1過表達后,CTGF、AT1R基因的表達上調,PI3K和Akt蛋白的磷酸化水平上調,Bc12/Bax的比值增加,細胞活力升高,COL1A1、COL3A1表達量上調;反之,mIGF1低表達后,CTGF、AT1R基因的表達下調,PI3K和Akt蛋白的磷酸化水平下調,Bc12/Bax的比值降低,細胞活力減弱,COL1A1、COL3A1表達量下調。2.相對于陰性對照組,起搏組AERP顯著降低,房顫誘發(fā)率升高;而相對于起搏組,起搏+mIGF1沉默病毒組AERP增高,但仍低于陰性對照組,房顫誘發(fā)率有所改善。3.免疫組化與Masson染色結果顯示,與陰性對照組比較,起搏組心房組織mIGF1表達量上調,TGF-β1、CTGF 陽性指標含量增加,纖維化程度加重;而與起搏組比較,起搏+mIGF1沉默病毒組心房組織mIGF1表達量下調,TGF-β1、CTGF陽性指標含量降低,纖維化程度減弱。結論1.我們發(fā)現mIGF1與房顫結構重構密切相關,且通過功能沉默實驗明確了mIGF1在房顫心房肌纖維化中的作用;2.mIGF1通過激活PI3K-Akt通路上調CTGF、AT1R的表達發(fā)揮致纖維化作用。創(chuàng)新性1.通過測序分析,明確了房顫重構相關的轉錄本表達譜變化。2.探索mIGF1調控房顫心房肌纖維化的分子機制,有助于房顫發(fā)生與維持機制的研究,有望為房顫的防治提供潛在的干預靶點;3.借助于腺相關病毒介導的體內基因表達調控技術,研究mIGF1對房顫心房結構重構的影響及機制。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R541.75

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本文編號：2772651