發(fā)布時(shí)間：2020-07-27 14:25

【摘要】：[背景與目的]:巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的形成是引起動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。因此,抑制泡沫細(xì)胞的形成是防治As的重要策略。三磷酸腺苷結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)和三磷酸腺苷結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G1(ATP-binding cassette transporter G1,ABCG1)都是一類整合膜蛋白,它們以ATP為能源促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇和磷脂的流出到細(xì)胞表面乏脂的載脂蛋白A-Ⅰ(apolipoprotein,apo A-I)或新生的高密度脂蛋白(nascent high-density lipoprotein,n HDL),并轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟進(jìn)行代謝,抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇大量蓄積,導(dǎo)致巨噬細(xì)胞泡沫化,進(jìn)而抗As的作用。因此,挖掘調(diào)控ABCA1和ABCG1的表達(dá)機(jī)制,促進(jìn)細(xì)胞膽固醇流出,對(duì)于As防治具有重要的意義。熱休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)是一組高度保守的伴侶蛋白。它可以調(diào)節(jié)多種蛋白質(zhì)的活性和功能,具有維護(hù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,提高細(xì)胞對(duì)應(yīng)激原的耐受性,增加協(xié)同免疫等功能作用。此外,HSPs在細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)中也扮演著重要作用。近幾年研究顯示,心血管疾病患者的血漿中熱休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)水平明顯的高于正常人,提示HSP70可能與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。相關(guān)研究報(bào)道,HSP70可以通過巨噬細(xì)胞表面Toll樣受體,活化核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)細(xì)胞信號(hào)通路,激活細(xì)胞間粘附分子1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1)、E-選擇素(E-selectin)、血管細(xì)胞粘附分子1(vascular cell adhesionmolecule-1,VCAM-1)及白介素6(interleukin,IL-6)等黏附分子和細(xì)胞因子的表達(dá),激活炎癥細(xì)胞,引發(fā)炎性反應(yīng),促進(jìn)As的發(fā)生發(fā)展。但是,HSP70是否能夠通過膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)影響As及其潛在機(jī)制仍不清楚。因此,本研究的目的是從脂質(zhì)代謝的角度,探究HSP70對(duì)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)與As的影響及其潛在機(jī)制。該研究有助于明確以HSP70為代表的熱休克蛋白在調(diào)節(jié)RCT和As中的作用,為開發(fā)防治As的藥物提供了理論依據(jù)和新的靶點(diǎn)。[方法]:采用病毒轉(zhuǎn)染過表達(dá)HSP70,并通過Western Blot檢測轉(zhuǎn)染效率,進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。首先,采用高效液相色譜儀和細(xì)胞油紅O染色,檢測HSP70過表達(dá)后巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量情況;運(yùn)用q PCR和Western Blot,檢測過表達(dá)HSP70后對(duì)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCA1和ABCG1表達(dá)的影響;通過液體閃爍計(jì)數(shù)儀,檢測HSP70對(duì)膽固醇流出的影響;采用熒光素酶報(bào)告基因和染色質(zhì)免疫共沉淀分別檢測HSP70對(duì)轉(zhuǎn)錄因子Elk-1與ABCA1和ABCG1啟動(dòng)子的結(jié)合情況;Elk-1過表達(dá)后和JNK激活劑茴香霉素處理后,通過q PCR或Western Blot分別檢測JNK和Elk-1的磷酸化水平與ABCA1和ABCG1的表達(dá)情況,驗(yàn)證HSP70是否通過JNK/Elk-1信號(hào)通路影響ABCA1和ABCG1的表達(dá)。最后,在apo E-/-小鼠體內(nèi)過表達(dá)HSP70,使用[3H]標(biāo)記的膽固醇檢測HSP70對(duì)小鼠RCT的影響;采用油紅O、HE和Masson染色評(píng)估小鼠動(dòng)脈粥樣斑塊的形成情況;收集小鼠的主動(dòng)脈,采用q PCR和Western Blot以及免疫熒光等方法,檢測小鼠主動(dòng)脈和動(dòng)脈粥樣斑塊中ABCA1和ABCG1表達(dá)水平。[結(jié)果]:Western Blot檢測結(jié)果顯示病毒轉(zhuǎn)染后HSP70蛋白表達(dá)顯著性增加,說明了細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)HSP70的模型構(gòu)建成功。通過油紅O染色和高效液相色譜儀檢測表明,過表達(dá)HSP70能夠增加巨噬細(xì)胞內(nèi)總膽固醇、膽固醇酯、游離膽固醇的含量;進(jìn)而檢測HSP70過表達(dá)后ABCA1和ABCG1表達(dá)水平以及細(xì)胞膽固醇流出情況,結(jié)果顯示過表達(dá)HSP70明顯降低了ABCA1和ABCG1蛋白質(zhì)和m RNA的水平,減少ABCA1和ABCG1介導(dǎo)的膽固醇流出。進(jìn)一步探究HSP70調(diào)控ABCA1和ABCG1表達(dá)的機(jī)制。熒光素酶報(bào)告基因和染色質(zhì)免疫共沉淀的結(jié)果顯示,HSP70降低了ABCA1和ABCG1啟動(dòng)子的活性,以及抑制Elk-1與ABCA1和ABCG1啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合;q PCR和Western Blot檢測顯示,過表達(dá)HSP70顯著性的抑制了Elk-1的活性,但是Elk-1過表達(dá)后,能夠逆轉(zhuǎn)過HSP70對(duì)ABCA1和ABCG1的抑制作用,說明了Elk-1是HSP70調(diào)控ABCA1和ABCG1表達(dá)的關(guān)鍵因子;Elk-1位于MAPKs信號(hào)通路上,其中JNK是Elk-1的上游,進(jìn)一步檢測HSP70對(duì)JNK的影響,結(jié)果表明過表達(dá)HSP70阻止了JNK的激活,并且JNK激活劑茴香霉素處理后,能夠恢復(fù)Elk-1的活性與ABCA1和ABCA1的表達(dá),證明了HSP70抑制ABCA1和ABCG1的表達(dá)通過JNK/Elk-1信號(hào)途徑;通過檢測小鼠血漿、肝臟和糞便中[3H]的含量,顯示HSP70能夠降低小鼠體內(nèi)的RCT效率;小鼠心臟的主動(dòng)脈瓣的冰凍切片染色顯示,HSP70能夠顯著的促進(jìn)動(dòng)脈粥樣斑塊的形成;檢測小鼠主動(dòng)脈和斑塊內(nèi)的ABCA1和ABCG1的表達(dá)情況,表明過表達(dá)HSP70能夠下調(diào)ABCA1和ABCG1的表達(dá)。[結(jié)論]:1.HSP70通過抑制JNK磷酸化,阻止Elk-1與ABCA1和ABCG1啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合,下調(diào)ABCA1和ABCG1的表達(dá),降低其介導(dǎo)的膽固醇流出,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積。2.HSP70通過抑制ABCA1和ABCG1的表達(dá),減少HDL水平,降低膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn),促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R543.5
【圖文】：

控的膽固醇流出為切入點(diǎn)，在細(xì)胞水平上深入探討 HSP70 對(duì)膽固醇流出的影響，并提出 HSP70 通過阻斷 JNK/Elk-1 信號(hào)通路，抑制 ABCA1 和 ABCG1 表達(dá)及其介導(dǎo)的膽固醇流出和 RCT 效率，引發(fā)脂質(zhì)代謝紊亂，發(fā)揮致 As 發(fā)生發(fā)展的假說（如圖 1.1）。本課題不僅有助于闡明 HSP70 調(diào)控 As 的新機(jī)制，明確以 HSP70為代表的熱休克蛋白在調(diào)控 RCT 和影響 As 發(fā)生發(fā)展中的作用，同時(shí)與明確了JNK/Elk-1 信號(hào)通路在調(diào)節(jié) ABCA1 和 ABCG1 及其介導(dǎo)的膽固醇流出的作用，豐富了膽固醇流出的調(diào)控機(jī)制，為開發(fā)防治 As 的藥物提供了新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。綜合以上文獻(xiàn)分析和本課題組的前期研究基礎(chǔ)，我們提出 HSP70 通過JNK/Elk-1 信號(hào)通路下調(diào) ABCA1 和 ABCG1 的表達(dá)，抑制膽固醇流出，促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成，加劇 As 發(fā)生發(fā)展的科學(xué)問題。

第 4 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果第 4 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果增加巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積用病毒載體轉(zhuǎn)染 THP-1 源性的巨噬細(xì) Western Blot 檢測其轉(zhuǎn)染效率，其結(jié)果達(dá)明顯高于對(duì)照組和病毒空載體轉(zhuǎn)染組（

圖 4.1 巨噬細(xì)胞內(nèi) HSP70 病毒載體轉(zhuǎn)染效率情況**P<0.01 與 Control 組比較（n=3）接著，油紅 O 染色檢測 HSP70 過表達(dá)后，巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積水平。結(jié)，HSP70 過表達(dá)后，巨噬細(xì)胞內(nèi)被染成紅色的區(qū)域與對(duì)照組和病毒空載體較明顯增多（如圖 4.2），說明了 HSP70 可能能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2771962