【摘要】：動脈粥樣硬化是引起心血管疾病的重要原因,在其發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用,可引起缺血性心臟病、缺血性中風(fēng)和外周動脈疾病等。我國心血管疾病的發(fā)病率和死亡率不斷上升,其死亡率目前排名第一。預(yù)防和治療動脈粥樣硬化對改善心血管疾病患者的預(yù)后至關(guān)重要。動脈粥樣硬化的形成是一個復(fù)雜的過程,涉及內(nèi)皮功能障礙、血管新生、自噬與凋亡、氧化應(yīng)激、非編碼RNA、基質(zhì)降解、膽固醇、炎癥和血栓形成等多種機(jī)制,其中炎癥和免疫系統(tǒng)在其發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。目前關(guān)于動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制和發(fā)展有不同的解釋,大量研究表明ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷或功能障礙是動脈粥樣硬化中最早發(fā)生的事件,在多種疾病的發(fā)病機(jī)制中有重要作用。內(nèi)皮細(xì)胞作為心血管疾病治療的重要靶點(diǎn),用ox-LDL刺激內(nèi)皮細(xì)胞來模擬動脈粥樣硬化病變是研究動脈粥樣硬化的一個有效方法。糖基化在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能和復(fù)雜生物過程中起著重要的作用。糖基化異常與自身免疫疾病、炎癥和感染性疾病等多種疾病相關(guān)。研究表明糖基化可以通過影響粘附分子和趨化因子受體來影響白細(xì)胞的聚集,進(jìn)而抑制動脈粥樣化的形成,說明糖基化異�？赡苁且饎用}粥樣硬化的原因之一。用組學(xué)方法對糖基化位點(diǎn)、糖蛋白及糖鏈進(jìn)行表征,是研究糖基化在動脈粥樣硬化的中發(fā)揮生物功能及開發(fā)新生物標(biāo)志物的有效手段。本論文通過ox-LDL刺激內(nèi)皮細(xì)胞來模擬動脈粥樣硬化中出現(xiàn)的內(nèi)皮損傷,對ox-LDL刺激的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行N-糖蛋白組學(xué)和N-糖組學(xué)研究。采用濾膜輔助的凝集素親和富集法對N-糖肽進(jìn)行富集,然后在H2180溶解的緩沖液中用PNGase F對糖鏈進(jìn)行釋放,用液質(zhì)聯(lián)用方法對糖蛋白、糖基化位點(diǎn)及糖鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征,并對差異糖基化位點(diǎn)占有率的糖蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。本次實驗共鑒定到1170個N-糖基化肽段,包含1248個N-糖基化位點(diǎn),分布在768個N-糖蛋白上。其中N-糖基化位點(diǎn)占有率的變化大于1.3倍的共有120條糖肽,分布于92個糖蛋白上。GO功能富集結(jié)果表明這些差異糖蛋白主要分布在膜、細(xì)胞表面、胞外、液泡及溶酶體,在蛋白復(fù)合物結(jié)合、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合、受體結(jié)合和氧化還原酶活性等方面發(fā)揮重要作用。生物過程分析發(fā)現(xiàn)這些差異糖蛋白在細(xì)胞粘附、基質(zhì)粘附、細(xì)胞遷移、細(xì)胞定位和應(yīng)激反應(yīng)等生物過程中發(fā)揮廣泛生物學(xué)功能。蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中以整合素家族形成的子網(wǎng)絡(luò)為中心且密集程度最高。信號通路富集中最為顯著的信號通路為P13K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,其次溶酶體、黏著斑和細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用等通路也有富集到。經(jīng)過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)整合素的糖基化修飾在ox-LDL刺激下明顯變化,可能在致內(nèi)皮損傷中發(fā)揮重要作用。通過PGC-LC-MS對內(nèi)皮細(xì)胞N-糖鏈進(jìn)行分析后共檢測到100種不同分子量的N-糖鏈,其中有兩種為ox-LDL刺激組特有,相對定量后發(fā)現(xiàn)52種N-糖鏈的變化在1.3倍以上,對所有糖鏈整體分析發(fā)現(xiàn)高唾液酸修飾的N-糖鏈含量明顯增加。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：O657.63;R54
【圖文】：

Ｏｘ－ＬＤＬ通過多種不同的機(jī)制參與動脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展，包括逡逑誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活化和功能障礙、巨噬細(xì)胞及泡沫細(xì)胞的形成、平滑肌細(xì)胞的遷移逡逑和增殖等動脈粥樣硬化病變形成的過程如下圖１－１：血管內(nèi)皮細(xì)胞受刺激活逡逑化后，表達(dá)粘附分子并釋放細(xì)胞因子和趨化因子；在趨化因子作用下，單核細(xì)胞逡逑通過血液循環(huán)聚集到損傷區(qū)域，通過與粘附分子的相互作用附著在內(nèi)皮細(xì)胞上；逡逑然后單核細(xì)胞從內(nèi)皮間隙中穿過后繼而分化成為巨噬細(xì)胞；巨噬細(xì)胞可以通過清逡逑道夫受體對ｏｘ－ＬＤＬ進(jìn)行吸收，引起脂質(zhì)積累和泡沫細(xì)胞的形成；此外巨噬細(xì)胞逡逑活化后通過促進(jìn)活性氧、促炎因子和參與基質(zhì)降解的蛋白水解酶的釋放來促進(jìn)動逡逑脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定；血管平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化并遷移至內(nèi)膜后在內(nèi)膜中增殖并逡逑產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致內(nèi)膜增厚和硬化，這些轉(zhuǎn)化的血管平滑肌細(xì)胞也會吸收0ｘ－逡逑ＬＤＬ促進(jìn)動脈粥樣硬化的形成［５］。血漿中的ｏｘ－ＬＤＬ或其抗體己被發(fā)現(xiàn)與心血管逡逑１逡逑

種凝集素富集、ＰＮＧａｓｅ邋Ｆ糖鏈釋放和ｉＴＲＱＡ標(biāo)記，經(jīng)２Ｄ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ進(jìn)行質(zhì)譜逡逑分析，最后質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)ＰＤ軟件搜庫對糖基化位點(diǎn)、糖肽及糖蛋白進(jìn)行定性定量。逡逑如圖２－２，為整合素Ｐ５部分肽段的二級質(zhì)譜圖，其中天冬酰胺處的分子量與實際逡逑分子量相差２．９８８邋Ｄａ，說明該位點(diǎn)發(fā)生Ｍ糖基化。逡逑２５０邋－Ｊ邐【Ｍ＋１Ｈ１，逡逑１１０９．６６２４８逡逑＾邐—邋Ｐａ＾Ｈ，邋Ｐｒｉｗｒｓｔｉｒ，邋Ｐａｘｉｉｒｓｏｒ－Ｈ－０，邋Ｐａ＾ｒｗｒ－Ｈ＾ＮＨｉ，邋Ｐｒｔ＇ｏｉｒｓｏｒ－ＮＨｉ，邋Ｐｒｅ－Ｈ邐包ＮｊＭ舟ｔ［ｋ逡逑—ｂ＾Ｈｊｏｉｂ－ＮＨ，邐ｂ，邋ｂｊ邋ｂ３邋ｂ４邋ｂ５邋ｂ，逡逑＾邋１５０邋－逡逑ｌ邋＇ｌＪｌ逡逑！逡逑｜邋１００－邐ＩＭ＋１Ｈ１＊＋Ｈ逡逑ｙｒ－ＮＨ，邐ｂ３＊邐ｂ，邋１１１0＊＾�。撸咤义希保担福埃福保埃惯姡悖邋澹叮玻玻常担玻矗策姡梗常担担担玻常卞义希赀姡矗姡猓玻姡叮埃保矗埃保担靛澹姡捱姡保保埃福叮担罚矗峰义希担板澹н姡�

２．４．４蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)逡逑用Ｓｔｒｉｎｇ做蛋白互作網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)９５個差異蛋白中有５１個糖蛋白可與其它蛋白形逡逑成相互作用網(wǎng)絡(luò)。經(jīng)ＣｅｎｔｉＳｃａｐｅ和ＭＣＯＤＥ的中心度和ｋ核解析后作圖２－７，圖中節(jié)逡逑點(diǎn)大小是根據(jù)連接度（ｄｅｇｒｅｅ）顯示的，節(jié)點(diǎn)顏色是根據(jù)ＡＭｆ基化位點(diǎn)占有率的逡逑上下調(diào)決定，紅色表示上調(diào)，藍(lán)色下調(diào)，黃色為上下調(diào)均有出現(xiàn)。其中ＣＬＵ、逡逑ＡＬＣＡＭ、ＬＡＭＰ１和１ＧＦ２Ｒ四種蛋白中上調(diào)和下調(diào)均出現(xiàn)。研究表明主動脈組織逡逑中的叢生蛋白（ＣＬＵ）隨著動脈粥樣硬化從脂質(zhì)條紋向晚期病變的發(fā)展而增加。逡逑ＣＵＪ過度表達(dá)可以降低ＴＮＦ－ｏｃ／ＮＦｋＢ刺激產(chǎn)生的炎性趨化因子、細(xì)胞粘附分子和逡逑基質(zhì)降解內(nèi)肽酶，在動脈粥樣硬化的預(yù)防和治療中發(fā)揮保護(hù)作用ｔＳ７］�；罨陌准�(xì)逡逑胞粘附分子（ＡＬＣＡＭ／ＣＤＩ６６）可以介導(dǎo)細(xì)胞粘附并促進(jìn)Ｔ細(xì)胞活化和增殖，與細(xì)逡逑胞遷移和白細(xì)胞侵入血管壁有關(guān)。ＡＬＣＡＭ為結(jié)腸癌和前列腺癌的標(biāo)志物，具有逡逑２９逡逑

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