【摘要】：目的:組織蛋白酶S(CatS)通過修飾/分解各種生物活性物質(zhì)調(diào)控內(nèi)皮細胞(ECs)的生物活性。目前較多研究集中于CatS在動脈粥樣硬化性心血管疾病中的表達及其作用,而在缺血性血管生成中表達及作用鮮有報道。最近,過氧化物酶增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)在心血管系統(tǒng)和炎癥-免疫細胞中的表達及其作用越來越受到重視,而關(guān)于織蛋白酶S抑制劑(CatS-I)影響小鼠缺血誘導(dǎo)的血管再生的信號通路研究甚少,本研究通過建立小鼠下肢缺血模型,探討CatS-I影響小鼠缺血誘導(dǎo)的血管再生機制。方法:將8周齡、體重21～25g的野生型小鼠(C57/BL6,由日本名古屋大學(xué)動物實驗室提供)按照隨機數(shù)字表法分為兩組:對照組和CatS-I組,每組各20只。對照組采用基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)基礎(chǔ)上再腹腔注射5%羧甲基纖維素鈉鹽(CMC),每天1次,共17天;CatS-I組在基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)基礎(chǔ)上再腹腔注射CatS-I[1mg/(kg·d)],每天1次,共17天。3天后,對兩組小鼠腹腔注射戊巴比妥(60mg/kg)進行麻醉,切開小鼠左側(cè)下腹部皮膚后,分離股神經(jīng)結(jié)扎股動脈根部,剝離股動脈三個主要分支并結(jié)扎,然后切除股動脈主干及其分支,建立下肢缺血模型。采用激光多普勒血流成像儀分別測定術(shù)前、術(shù)后即刻、術(shù)后第4天、7天、14天血流,計算缺血肢與非缺血肢血流面積比;術(shù)后第4天取骨骼肌組織利用免疫印跡法檢測與血管再生有關(guān)分子的蛋白表達水平,如過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶(p-eNOS)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等蛋白水平;術(shù)后第14天,取骨骼肌組織作冰凍切片,采用CD31單克隆抗體免疫組化染色法標(biāo)記血管內(nèi)皮細胞以測定毛細血管數(shù)量和密度。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用Tukey post hoc test進行比較。計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗。P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:(1)CatS-I明顯抑制下肢血流的恢復(fù)。缺血與非缺血下肢血流比值統(tǒng)計結(jié)果顯示:CatS-I組小鼠缺血下肢血流恢復(fù)明顯慢于對照組(P0.05)。(2)CatS-I組明顯抑制毛細血管的形成。術(shù)后第14天非缺血骨骼肌中,與對照組比較,CatS-I組毛細血管形成略減少,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);但在缺血骨骼肌中,CatS-I組小鼠的毛細血管密度明顯低于對照組(P0.01)。(3)免疫印跡法檢測結(jié)果表明,CatS-I組小鼠中,PPAR-γ、p-Akt、p-eNOS和VEGF等蛋白表達水平與對照組比較明顯減少(P0.05)。結(jié)論:CatS調(diào)控缺血性血管再生可能與PPAR-γ激活及Akt/eNOS信號通路有關(guān),CatS有望成為治療缺血性心血管疾病的新的分子靶點。
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R54
【圖文】：

后即刻兩組小鼠缺血下肢血流無統(tǒng)計學(xué)差異；術(shù)后第４天ＣａｔＳ－Ｉ組小鼠缺血下肢血逡逑流恢復(fù)明顯慢于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（戶＜0．0１）；術(shù)后第７天、１４天ＣａｔＳ－Ｉ逡逑組缺血下肢血流恢復(fù)明顯慢于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（ＰＯ．Ｏ〗）（圖１）。逡逑對照組逡逑一對照詛逡逑＾邋＼邋＇邐１２邋邐逡逑術(shù)}卞危澹鈴危危у義蟢x邐ｆｌ邐ｗ邐0邋術(shù)省邋水后w\由１鉺４夭邐鉺７夭邋鉺１４夭逡逑圖１兩組缺血側(cè)與非缺血側(cè)下肢激光多普勒成像和血流灌注比值統(tǒng)計圖逡逑注：激光多普勒血流中，紅色代表高灌注，藍色代表低灌注。與對照組比較＂ＰＯ．Ｏ】邋＞＜０．０５，逡逑ｎ＝８逡逑３．２利用ＣＤ３１免疫組化染色觀察兩組骨骼肌毛細血管的形成逡逑術(shù)后第１４天，取兩組小鼠缺血與非缺血骨骼肌制作冰凍切片，利用ＣＤ３１免逡逑疫組化染色法觀察毛細血管的形成。ＣＤ３１免疫組化染色圖譜觀察到：在非缺血骨逡逑骼肌中，ＣａｔＳ－Ｉ組毛細血管形成與對照組比較減少；在缺血骨骼肌中ＣａｔＳ－Ｉ組毛逡逑細血管形成與對照組比較明顯減少。毛細血管密度統(tǒng)計圖觀察到：在非缺血骨骼逡逑９逡逑

圖２術(shù)后第１４天兩組小鼠缺血與非缺血骨骼肌中毛細血管密度比較卜４００）逡逑注：２Ａ：邋ＣＤ３１免疫組化染色圖譜；２Ｂ：毛細血管密度統(tǒng)計圖。ＮＳ：差異無意義。與對照組比較，＜0．0〗，ｎ＝６逡逑３．３免疫印跡法檢測兩組與血管再生有關(guān)分子的蛋白水平表術(shù)后第４天利用免疫蛋白印跡法檢測兩組與血管再生有關(guān)的分子蛋白平。免疫印跡圖觀察到：非缺血骨骼肌中，ＣａｔＳ－Ｉ組ＰＰＡＲ－丫、ｐ－Ａｋｔ、ｐ－ｅＮＯＶＥＧＦ蛋白表達水平與對照組比較無明顯差異。在缺血骨骼肌中，ＣａｔＳ－Ｉ中ＰＰＡＲ－丫、ｐ－ｅＮＯＳ、ｐ－Ａｋｔ和ＶＥＧＦ表達明顯低于對照組。半定量分析蛋白水平統(tǒng)計圖結(jié)果表明：非缺血骨骼肌中，ＣａｔＳ－Ｉ組ＰＰＡＲ－Ｙ、ｐ－Ａｋｔ、ｐ－ｅＮＯＳ和Ｖ蛋白水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在缺血骨骼肌中，ＣａｔＳ－Ｉ組ＰＰＡｐ－ｅＮＯＳ和ＶＥＧＦ表達明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Ｐ＜０．００１）邋；邋Ｃ組ｐ－Ａｋｔ表達明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ＰＯ．ＯＳ）（圖３）。逡逑１．６逡逑■邋ＰＰＡＲｙ逡逑＾ａｎｉ§ｔ８ｍ．邋sρ赭缹╁義

本文編號：2766505