【摘要】：目的:動脈粥樣硬化是冠心病,缺血性中風(fēng)和外周動脈疾病的主要原因。動脈粥樣硬化病變可能直接或間接造成動脈狹窄或閉塞,影響重要器官的血供,并引起相應(yīng)的缺血癥狀。介入經(jīng)皮血管成形術(shù)及支架置入術(shù)是治療閉塞性動脈疾病的主要方法。隨著介入器械的發(fā)展及技術(shù)的進(jìn)步,介入腔內(nèi)治療閉塞性動脈疾病有了長遠(yuǎn)的進(jìn)步,但術(shù)后再狹窄問題仍然沒有徹底解決。內(nèi)膜增生是術(shù)后再狹窄的主要病理過程,新生內(nèi)膜病變主要來源于由中膜向內(nèi)膜異常增殖和遷移的血管平滑肌細(xì)胞。最近的一些研究指出血管再狹窄可能受到飲食因素及遺傳因素等的影響。前期研究中我們發(fā)現(xiàn) C3H/HeJ(C3H)和 C57BL/6J 小鼠在載脂蛋白-E(Apolipoprotein E,Apoe)敲除后動脈硬化易感性差異顯著。通過數(shù)量性狀基因座(Quantitative trait loci,QTL)的方法發(fā)現(xiàn)網(wǎng)鈣結(jié)合蛋白2(Reticulocalbin-2,Rcn2)可能是導(dǎo)致這一差異的關(guān)鍵基因。本研究將首先通過動物實(shí)驗(yàn)明確Rcn2在高脂飲食加劇動脈損傷后內(nèi)膜增生過程中的作用,并進(jìn)一步探討敲除Rcn2能夠抑制內(nèi)膜增生。其次通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)明確沉默Rcn2能否抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖遷移及由氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)誘發(fā)的炎癥反應(yīng)。最后在下肢動脈硬化閉塞癥患者血漿中檢測Rcn2表達(dá)水平,分析Rcn2能否成為預(yù)測支架后再狹窄的生物學(xué)標(biāo)志物。研究方法:1、動物實(shí)驗(yàn)中選取8-12周齡、體重20-25g的C57BL/6Apoe-/-小鼠(C57)、C57BL/6Apoe-/-Rcn2-/-小鼠(Rcn2),建立頸動脈結(jié)扎損傷模型。一組小鼠維持普通飲食,另一組在頸動脈損傷前1周開始喂食高脂飲食并一直維持高脂飲食至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。分別于術(shù)后1天,3天,及1,2和4周獲得頸動脈標(biāo)本。病理學(xué)檢查比較損傷段頸動脈管腔面積,內(nèi)膜面積,內(nèi)膜與中膜面積比值等形態(tài)學(xué)指標(biāo)。免疫組化染色鑒定內(nèi)膜增生病變的細(xì)胞成分。ELISA檢測動物血清促炎因子分泌水平及血脂。2、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)利用原代培養(yǎng)C57小鼠主動脈平滑肌細(xì)胞,選擇用不同濃度的ox-LDL(50ug/ml、100ug/ml、150ug/ml、200ug/ml)刺激血管平滑肌細(xì)胞后,檢測Rcn2在mRNA水平和蛋白水平表達(dá)情況。利用siRNA轉(zhuǎn)染血管平滑肌細(xì)胞,劃痕試驗(yàn)檢測血管平滑肌細(xì)胞的遷移能力。MTT檢測血管平滑肌細(xì)胞的增殖能力。ELISA法檢測細(xì)胞上清液中單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)及血管細(xì)胞粘附因子-1(VCAM-1)的水平。3、收集2012年1月至2014年12月258例連續(xù)的股胭動脈慢性完全閉塞(CTO)病變患者的臨床隨訪資料。其中180例患者納入本研究,檢測了其中62例患者留存血漿中的Rcn2水平,并與15例健康對照比較分析。同時還分析了所有患者中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值(NLR)與再狹窄等的相關(guān)性。結(jié)果:1、普通飲食組C57小鼠發(fā)生了輕度高脂血癥,總膽固醇水平為308.5±60.3mg/dl,而高脂飲食組的總膽固醇水平為858.5±88.4mg/dl,為嚴(yán)重高脂血癥(p0.001)。兩組高密度脂蛋白(HDL)水平都很低,甘油三酯水平相當(dāng)(159.3±37.1 mg/dl和149.5±19.2mg/dl,p0.05)。高脂飲食組在術(shù)后1周后出現(xiàn)內(nèi)膜增生,普通飲食組在術(shù)后2周出現(xiàn)內(nèi)膜增生。隨著時間的增加,兩組內(nèi)膜病灶均增大。術(shù)后4周時,高脂飲食組頸動脈平均內(nèi)膜增生面積大約為普通飲食組的4倍(分別為112,987±11,395μm2和 29,539±7,0011μm2;n = 5,P0.001)。組織學(xué)上,高脂飲食術(shù)后1周后和普通飲食術(shù)后2周的內(nèi)膜病變主要由泡沫細(xì)胞組成。在高脂飲食術(shù)后2周,內(nèi)膜增生是典型的纖維斑塊,其含有被纖維帽覆蓋的許多泡沫細(xì)胞。在4周時,兩個飲食組的內(nèi)膜病變發(fā)展到更晚期的階段,包含新生血管和動脈管腔明顯變窄。Rcn2在普通飲食組的內(nèi)膜病變中低表達(dá),而在高脂飲食組的內(nèi)膜病變中高表達(dá)。Rcn2在高脂飲食組血漿中濃度明顯高于普通飲食組(18.93±1.76ng/ml,33.03±15.0lng/ml,n=5,p=0.029)。Rcn2小鼠在高脂飲食情況下發(fā)生了輕度高脂血癥,總膽固醇水平明顯低于C57小鼠(264±56mg/dl和858.5±88.4mg/dl,n=5,p0.001),HDL膽固醇和甘油三酯在兩組中均無差異。Rcn2敲除明顯抑制高脂飲食條件下,C57小鼠頸動脈損傷后內(nèi)膜增生。主要抑制血管平滑肌細(xì)胞由中層向內(nèi)膜下遷移,抑制血管壁細(xì)胞MCP-1的表達(dá)。術(shù)后4周,在Rcn2小鼠血漿中MCP-1(202.3±39.6ng/ml,349.3±67.1ng/ml,n=5,p=0.009)及 VCAM-1(110.6±20.7ng/ml,240.3±50.lng/ml,n=5,p=0.002)濃度明顯低于C57小鼠。2、選擇用不同濃度的ox-LDL(50ug/ml,100ug/ml,150ug/ml,200ug/ml)刺激血管平滑肌細(xì)胞 4 小時,Rcn2 的 mRNA表達(dá)和蛋白水平在150ug/ml時表達(dá)最高。用siRcn2轉(zhuǎn)染血管平滑肌細(xì)胞后用ox-LDL刺激24小時,MTT測試顯示,沉默Rcn2可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞增殖(p0.05)。用平板劃痕實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)沉默Rcn2后,穿過劃痕的血管平滑肌細(xì)胞數(shù)量顯著減少(p0.05)。ELISA檢測細(xì)胞上清液中MCP-1及VCAM-1濃度顯示沉默Rcn2可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞分泌MCP-1及VCAM-1(p0.05)。3、共180例接受支架植入的股胭動脈CTO患者納入本研究。根據(jù)支架再狹窄(ISR)的發(fā)生情況和ISR發(fā)生的時間將患者分為3組:非ISR組、早期ISR組(1年內(nèi))及晚期ISR組。非ISR組和早期ISR組的基線NLR,糖尿病,高脂血癥,平均病變長度,流出道數(shù)量存在顯著差異。在早期ISR組,基線NLR明顯高于晚期ISR組(P = 0.03),且兩組在處理ISR過程中球囊預(yù)擴(kuò)張使用率(P0.01),遠(yuǎn)端栓塞發(fā)生率(P0.01)存在差異。單變量分析顯示,基線NLR≥3.62與早期ISR相關(guān),基線NLR3.62和NLR≥3.62組的早期ISR率分別為16%和32.72%(P0.01)。多變量logistic分析提示,基線NLR≥3.62是股胭動脈CTO患者支架置入術(shù)后早期ISR的獨(dú)立預(yù)測因子。共檢測其中62例患者及15例健康對照的血漿Rcn2濃度。依據(jù)患者在隨訪1年時是否出現(xiàn)再狹窄分為未再狹窄組和再狹窄組。采用單因素方差分析組間差異,發(fā)現(xiàn)三組Rcn2濃度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=29.59,P0.001)。Rcn2濃度與NLR明顯正相關(guān),而且Rcn2濃度與低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)及缺血程度均相關(guān)。受試者操作特征曲線分析(ROC)用Rcn2和ISR來定義Rcn2臨界值。ROC曲線下面積為0.901,Rcn2水平為80.43 ng/ml作為臨界值,預(yù)測再狹窄的敏感性和特異性分別為 79.92%和 83.722%(p0.001)。結(jié)論:1、高脂飲食明顯加劇C57小鼠頸動脈損傷后內(nèi)膜增生。增生的內(nèi)膜病變主要包括血管平滑肌細(xì)胞、泡沫細(xì)胞以及新生血管等。Rcn2在高脂飲食誘導(dǎo)的C57小鼠動脈內(nèi)膜病變中高表達(dá)。Rcn2敲除能夠明顯抑制高血脂誘導(dǎo)動脈損傷后的內(nèi)膜增生。2、ox-LDL能夠誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞Rcn2表達(dá)增加。沉默Rcn2能夠有效抑制ox-LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖及遷移。沉默Rcn2能夠有效抑制ox-LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞促炎因子分泌。3、基線NLR≥3.62是股胭動脈CTO患者支架置入術(shù)后早期ISR的獨(dú)立預(yù)測因子�；�NLR與ISR再次介入的難易程度和遠(yuǎn)端栓塞發(fā)生有關(guān)。Rcn2在股胭動脈CTO患者中表達(dá)明顯升高。Rcn2與NLR呈正相關(guān),并與患者下肢缺血程度及LDL-c水平相關(guān)。Rcn2有望成為下肢動脈硬化閉塞癥介入術(shù)后再狹窄的生物學(xué)標(biāo)志物。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R543.5
【圖文】：

P<0.01），見圖3.2。圖3.2股乆動脈完全閉塞患者及健康對照血漿Rcn2水平Rcn2水平與NLR明顯正相關(guān),而且Rcn2水平與低密度脂蛋白膽固醇及缺血程度相關(guān)，見圖3.3,3.4,3.5。圖3.3，Rcn2濃度與NLR相關(guān)性分析

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文41圖3.4 Rcn2水平與下肢動脈硬化患者血脂及缺血程度的關(guān)系血脂正常0 2 4 6050100150200R=0.57p<0.01LDL-c(mmol/L)Rcn2(ng/ml)圖3.5 Rcn2水平與低密度脂蛋白膽固醇相關(guān)性分析受試者操作特征曲線分析用Rcn2和早期ISR來定義Rcn2臨界值。ROC曲線下面積為0.901，Rcn2為80.43 ng/ml，敏感性和特異性分別為79.92％和83.72％（p<0.001），詳見圖3.6。

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文42圖3.6 ROC曲線分析Rcn2預(yù)測下肢股乆動脈慢性完全閉塞患者支架再狹窄的效能4討論大量研究顯示炎癥在ISR過程中起關(guān)鍵作用[45; 50; 131; 132]。炎癥標(biāo)志物如CRP被廣泛使用[74-76; 133; 134]。在炎癥標(biāo)志物中，NLR是一種簡單，相對便宜并且容易獲得的指標(biāo);已被認(rèn)為是動脈粥樣硬化性心血管疾病分層和預(yù)后的有效生物標(biāo)志物[48-53]。本研究NLR與CRP呈正相關(guān)。我們研究的平均NLR高于大多數(shù)其他研究報道的[48-53]。這種差異可能是由于研究設(shè)計(jì)差異所致。本研究納入的患者為股乆動脈CTO患者。股乆動脈CTO病變的患者動脈粥樣硬化程度較重[117; 135; 136]，我們推測嚴(yán)重的動脈粥樣硬化可導(dǎo)致更高的NLR。我們研究中最重要的發(fā)現(xiàn)是，基線NLR≥3.62 與早期 ISR 風(fēng)險呈獨(dú)立正相關(guān)。在支架周圍發(fā)生血小板和纖維蛋白沉積后，初始急性炎癥伴隨新生血管形成，平滑肌細(xì)胞遷移，增殖以及在幾周內(nèi)，慢性炎性細(xì)胞將代替急性炎性細(xì)胞形成肉芽組織[45; 70; 108; 132; 137]。在我們的研究中，晚期ISR的基線NLR低于非ISR的基線NLR

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1 暢智慧;網(wǎng)鈣結(jié)合蛋白-2（Rcn2）對動脈損傷后內(nèi)膜增生的影響及機(jī)制研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2018年

本文編號：2766468