【摘要】：背景:缺血性心臟病(Ischemic heart disease,IHD)是全球范圍內(nèi)人類(lèi)最主要的致死病因,同時(shí)IHD耗費(fèi)醫(yī)療資源驚人。美國(guó)最新數(shù)據(jù)顯示,其住院及門(mén)診ST段抬高心梗病人人均費(fèi)用分別為24.5萬(wàn)美元和12.9萬(wàn)美元。通過(guò)溶栓、PCI等治療手段盡快恢復(fù)血流供應(yīng)是挽救患者生命的關(guān)鍵,但令人遺憾的是,血運(yùn)重建在避免直接致死后果的同時(shí)又可引發(fā)心肌繼發(fā)性的損害——缺血再灌注損傷(Ischemia-reperfusion injury,IRI)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示將近50%的壞死心肌是由于再灌注損傷所引起,臨床研究也表明缺血再灌注損傷會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的心律失常并加重心肌損傷,嚴(yán)重影響預(yù)后。因此有效的防治IRI是治療IHD亟待解決的重要臨床問(wèn)題。研究發(fā)現(xiàn),在心臟致死性缺血前,給予遠(yuǎn)離心臟的肢端多次短暫缺血刺激,可以大幅減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的心肌梗死面積,這一現(xiàn)象被稱(chēng)為遠(yuǎn)端缺血預(yù)適應(yīng)(Remote ischemic preconditioning,RIPC)。然而RIPC調(diào)控因子及其機(jī)制非常復(fù)雜,深入探討RIPC心肌保護(hù)因子及其機(jī)制具有重要的意義。外泌體(exosome)是一種近年才引起關(guān)注的內(nèi)源性顆粒,它是由細(xì)胞內(nèi)多囊泡體與細(xì)胞膜融合而釋放到細(xì)胞外的囊泡狀小體,直徑30~120nm。外泌體曾一度被認(rèn)為是沒(méi)有生物活性的細(xì)胞碎片,但后續(xù)研究證實(shí)不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以攜帶不同的生物活性分子,如蛋白質(zhì)、m RNA、mi RNA等,充當(dāng)細(xì)胞間信息交流的中介,參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生物學(xué)功能。生理狀態(tài)下的細(xì)胞可以釋放少量的外泌體,而在一定的內(nèi)、外刺激(如信號(hào)通路激活、應(yīng)激等)情況下,可以誘發(fā)細(xì)胞分泌大量的外泌體。缺血缺氧對(duì)機(jī)體組織器官而言是巨大的刺激,多種細(xì)胞都因此而分泌外泌體,這些外泌體首先進(jìn)入周邊細(xì)胞外液,并最終匯聚于血液循環(huán)中。外泌體是有著雙層膜結(jié)構(gòu)的帶負(fù)電荷(-26m V)的微粒,并表達(dá)CD63等表面分子,這些特性使得它易于被IRI心肌細(xì)胞攝取吸收,并遞送其攜帶的生物活性分子。有研究證明外泌體介導(dǎo)了缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制,但是具體機(jī)制不明確。我們前期結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理后的外泌體中mi R-24的含量明顯上升,而mi R-24能夠通過(guò)下調(diào)促凋亡蛋白Bim的表達(dá)減輕心肌細(xì)胞的凋亡。綜上所述,我們推測(cè)RIPC后遠(yuǎn)端缺血區(qū)釋放大量的外泌體入血,這些攜帶高濃度mi R-24的外泌體隨血液循環(huán)至再灌注的心臟內(nèi),被IRI心肌細(xì)胞攝取吸收,mi R-24在心肌細(xì)胞內(nèi)下調(diào)靶蛋白Bim的表達(dá),減輕心肌細(xì)胞凋亡,減少缺血再灌注損傷。為了證實(shí)這一推測(cè)。我們將進(jìn)行以下研究:首先,通過(guò)建立大鼠遠(yuǎn)端缺血預(yù)適應(yīng)模型,提取遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理后大鼠血漿中的外泌體,驗(yàn)證外泌體的純度及濃度,并進(jìn)一步檢測(cè)外泌體中相關(guān)mi RNA的表達(dá)情況。其次,在體外實(shí)驗(yàn)中使用過(guò)氧化氫處理的方法建立氧化應(yīng)激損傷的細(xì)胞模型,并觀察遠(yuǎn)端缺血預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)的外泌體是否能夠減輕細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷及其相關(guān)機(jī)制研究。最后,建立大鼠的缺血再灌注損傷模型,將經(jīng)過(guò)遠(yuǎn)端缺血預(yù)適應(yīng)的外泌體注射至心肌中,驗(yàn)證是否能夠減輕大鼠心臟心臟缺血再灌注損傷,改善心功能。第一部分遠(yuǎn)端肢體缺血預(yù)適應(yīng)模型的建立及外泌體的提取與鑒定目的:建立遠(yuǎn)端缺血預(yù)適應(yīng)模型,提取外泌體并明確外泌體中相關(guān)mi RNA的表達(dá)水平。方法:1)用止血帶結(jié)扎大鼠雙后肢的方法建立大鼠遠(yuǎn)端缺血預(yù)適應(yīng)模型,運(yùn)用激光多普勒血流儀驗(yàn)證模型建立是否成功。2)采集經(jīng)遠(yuǎn)端缺血預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)前后大鼠血漿中的外泌體,WB檢測(cè)外泌體表面標(biāo)記蛋白CD63、CD9及CD81等表達(dá)情況,并運(yùn)用透射電鏡檢測(cè)外泌體的形態(tài)及大小。3)納米顆粒跟蹤分析儀檢測(cè)缺血預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)前后血漿中外泌體的濃度變化,并用RT-PCR方法檢測(cè)缺血預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)前后血漿中外泌體中相關(guān)mi RNA的表達(dá)水平。結(jié)果:1)激光多普勒血流儀結(jié)果顯示大鼠的雙后肢經(jīng)過(guò)止血帶結(jié)扎后,大鼠雙后肢的血流量明顯下降(P0.05)。2)WB結(jié)果顯示血漿外泌體表面標(biāo)記蛋白CD63、CD81及CD9均有表達(dá),而且與正常大鼠血漿的外泌體相比,經(jīng)過(guò)遠(yuǎn)端缺血預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)后的外泌體上述表面標(biāo)記蛋白的表達(dá)水平明顯上升(P0.05)。透射電鏡結(jié)果顯示外泌體的形態(tài)呈杯口狀,直徑在100 nm左右。3)納米顆粒跟蹤分析儀結(jié)果顯示與遠(yuǎn)端缺血預(yù)適應(yīng)前相比,經(jīng)過(guò)遠(yuǎn)端缺血預(yù)適應(yīng)處理后的外泌體數(shù)量明顯上升(P0.05)。4)RT-PCR結(jié)果顯示,與遠(yuǎn)端缺血預(yù)適應(yīng)前相比,經(jīng)過(guò)遠(yuǎn)端缺血預(yù)適應(yīng)處理后的外泌體中mi R-24的表達(dá)水平明顯升高(P0.05)。結(jié)論:1)成功建立大鼠遠(yuǎn)端缺血預(yù)適應(yīng)模型。2)經(jīng)過(guò)遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理后大鼠血漿中的外泌體不但數(shù)量明顯上升,而且外泌體中的mi R-24的表達(dá)水平也明顯上升。第二部分:遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理誘導(dǎo)外泌體遞送mi R-24減輕H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷目的:本研究擬建立H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型,從離體實(shí)驗(yàn)探討遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理誘導(dǎo)的外泌體對(duì)氧化應(yīng)激損傷的H9c2細(xì)胞的效應(yīng)機(jī)制。方法:1)給予100m M H2O2處理H9c2細(xì)胞6 h建立細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷模型,利用流式細(xì)胞儀、WB等方法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡水平,并用RT-PCR檢測(cè)mi R-24的表達(dá)水平。2)使用Lipo3000分別將mi R-24 mimic、mi R-24 inhibitor及兩組的空載組轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞,然后再給予H2O2處理。實(shí)驗(yàn)分成以下六組:Control組、H2O2treated組、H2O2 treated+mi R-24 mimic組、H2O2 treated+mi R-24 mimic negative control組、H2O2 treated+mi R-24 inhibitor組及H2O2 treated+mi R-24 inhibitor negative control組。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)上述各組細(xì)胞的凋亡情況,并運(yùn)用WB檢測(cè)促凋亡蛋白Bim及cleaved-caspase-3的表達(dá)情況。3)分別將遠(yuǎn)端缺血預(yù)適應(yīng)前后采集大鼠血漿中的外泌體加入到經(jīng)過(guò)H2O2處理的H9c2細(xì)胞中,實(shí)驗(yàn)分為以下六組:Control組、H2O2 treated組、H2O2treated+EXO組、H2O2 treated+RIPC-EXO組、H2O2 treated+RIPC-EXO+mi R-24inhibitor組及H2O2 treated+RIPC-EXO+mi R-24 inhibitor-NC組。然后用流式細(xì)胞儀及Tunel等檢測(cè)方法檢測(cè)上述各組細(xì)胞的凋亡情況,用WB檢測(cè)促凋亡蛋白Bim及cleaved-caspase-3的表達(dá)情況,并同時(shí)檢測(cè)各組mi R-24的表達(dá)水平。結(jié)果:1)H2O2處理后的H9c2細(xì)胞凋亡發(fā)生率明顯上升(P0.05),且H9c2細(xì)胞中mi R-24表達(dá)水平明顯下降。2)與H2O2 treated組相比,H2O2 treated+mi R-24 mimic組H9c2細(xì)胞存活率明顯增加(P0.05),流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞的凋亡率明顯下降(P0.05),WB檢測(cè)到Bim及cleaved-caspase-3凋亡蛋白的表達(dá)水平明顯下降(P0.05),而H2O2 treated+mi R-24 inhibitor組H9c2細(xì)胞存活率明顯降低(P0.05),WB檢測(cè)到Bim及cleaved-caspase-3促凋亡蛋白的表達(dá)水平明顯上升(P0.05),流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞的凋亡率明顯上升(P0.05)。3)與H2O2 treated組相比,H2O2 treated+EXO組H9c2細(xì)胞的存活率及細(xì)胞凋亡率沒(méi)有明顯變化(P0.05),mi R-24的表達(dá)水平未見(jiàn)明顯變化(P0.05),而H2O2 treated+RIPC-EXO組H9c2細(xì)胞的存活率明顯上升(P0.05),而且WB檢測(cè)到Bim及cleaved-caspase-3等凋亡蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)(P0.05),流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞的凋亡率明顯降低(P0.05),mi R-24的表達(dá)水平明顯上升(P0.05)。然而相比H2O2 treated+RIPC-EXO組,H2O2treated+RIPC-EXO+mi R-24 inhibitor組細(xì)胞的細(xì)胞存活率又明顯下降(P0.05),WB檢測(cè)到Bim及cleaved-caspase-3等凋亡蛋白的表達(dá)水平明顯上升(P0.05),流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示細(xì)胞的凋亡率明顯增加(P0.05),mi R-24的表達(dá)水平明顯下降(P0.05)。結(jié)論:1)H9c2細(xì)胞經(jīng)過(guò)氧化應(yīng)激處理后凋亡發(fā)生率明顯增加,mi R-24的表達(dá)水平明顯下調(diào)。2)遠(yuǎn)端缺血預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)的外泌體能夠減輕氧化應(yīng)激處理后H9c2細(xì)胞的凋亡,其保護(hù)機(jī)制與外泌體傳遞mi R-24至細(xì)胞中下調(diào)促凋亡蛋白Bim的表達(dá)有關(guān)。第三部分:遠(yuǎn)端肢體缺血預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)外泌體遞送mi R-24減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷目的:本研究擬建立大鼠缺血再灌注損傷模型,從在體實(shí)驗(yàn)探討遠(yuǎn)端缺血預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)的外泌體對(duì)大鼠心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)效應(yīng)。方法:1)通過(guò)可逆性結(jié)扎前降支45min,然后給予再灌注24h方法建立大鼠心臟缺血再灌注損傷模型,并用心電圖驗(yàn)證模型是否建立成功,并分別在造模前及造模后24h后給予大鼠行心臟超聲檢查。2)觀察RIPC處理后是否能夠改善心臟缺血再灌注損傷,將大鼠分為以下四組:sham組,RIPC組,I/R組及RIPC+I/R組,然后通過(guò)心臟超聲檢測(cè)各組大鼠的心臟功能情況,處死各組大鼠后,將心臟取出行TTC染色。3)將遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理誘導(dǎo)前后的外泌體通過(guò)心肌注射的方式至心肌缺血再灌注損傷周?chē)?并根據(jù)注射的內(nèi)容物不同分為以下六組:Control組、I/R+PBS組、I/R+EXO組、I/R+RIPC-EXO組、I/R+RIPC-EXO+mi R-24 antagomir組及I/R+RIPC-EXO+mi R-24 antagomir-NC組。再灌注24h后,用心臟超聲檢查各組大鼠的心功能情況,然后用深度麻醉的方式快速處死大鼠,并取心臟行TTC染色及心肌細(xì)胞TUNEL檢測(cè)心臟細(xì)胞凋亡的水平,運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)心臟mi R-24的表達(dá)情況。4)觀察遠(yuǎn)端缺血預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)的外泌體釋放是否和大鼠雙下肢HIF-1a蛋白表達(dá)水平升高有關(guān),將大鼠分為以下四組:sham組,Cd組(HIF-1a抑制劑注射組),RIPC組,Cd+RIPC組。然后分別觀察各組大鼠雙下肢的HIF-1a表達(dá)水平及各組大鼠血漿外泌體的濃度水平。結(jié)果:1)大鼠的缺血再灌注損傷模型建立后,心臟超聲提示心臟射血分?jǐn)?shù)明顯下降(P0.05),TTC染色結(jié)果提示心臟的缺血面積明顯增加(P0.05)。2)RIPC組大鼠相比sham組大鼠,心臟功能及TTC染色結(jié)果沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),而RIPC+I/R組相比I/R組,大鼠的心臟功能明顯改善(P0.05),心臟TTC染色結(jié)果顯示心臟的梗死面積明顯降低(P0.05)。3)與I/R+PBS組相比,I/R+EXO組的大鼠的心臟射血分?jǐn)?shù)沒(méi)有明顯變化(P0.05),TTC染色結(jié)果顯示心臟梗死面積沒(méi)有明顯下降(P0.05),TUNEL染色結(jié)果提示心臟細(xì)胞的凋亡率沒(méi)有明顯變化,而I/R+RIPC-EXO組的大鼠心臟射血分?jǐn)?shù)明顯提高,TTC染色結(jié)果顯示心臟梗死面積明顯下降(P0.05),TUNEL染色提示心臟細(xì)胞的凋亡率明顯降低(P0.05),然而相比I/R+RIPC-EXO組,I/R+RIPC-EXO+mi R-24 antagomir組大鼠心臟射血分?jǐn)?shù)又明顯下降(P0.05),TTC染色結(jié)果顯示心臟梗死面積明顯升高(P0.05),TUNEL染色提示心臟細(xì)胞的凋亡率明顯增加(P0.05)。4)大鼠經(jīng)過(guò)遠(yuǎn)端缺血預(yù)適應(yīng)后大鼠下肢的HIF-1a蛋白的表達(dá)水平明顯升高(P0.05),與RIPC組相比,Cd+RIPC組大鼠血漿外泌體的濃度明顯降低(P0.05)。結(jié)論:1)遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理能夠減輕大鼠心臟缺血再灌注引起的心臟損傷。2)遠(yuǎn)端缺血預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)的外泌體能夠傳遞mi R-24至缺血再灌注損傷的心肌細(xì)胞從而下調(diào)促凋亡蛋白Bim的表達(dá)減輕心臟缺血再灌注損傷。遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理后大鼠下肢的HIF-1a的表達(dá)水平升高能夠促進(jìn)血漿中外泌體的釋放。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R541
【圖文】：

遠(yuǎn)端缺血預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)的外泌體攜帶miR-24對(duì)缺血再灌注損傷心肌保護(hù)作用

第 2 章 遠(yuǎn)端缺血預(yù)適應(yīng)模型的建立及外泌體的提取與鑒定2.4 結(jié)果2.4.1 大鼠遠(yuǎn)端缺血預(yù)適應(yīng)模型成功建立我們使用激光多普勒血流儀檢測(cè)大鼠在使用止血帶結(jié)扎雙下肢之前及結(jié)扎之后的血流情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在使用止血帶結(jié)扎雙下肢后，雙下肢的血流相比結(jié)扎前明顯減少，見(jiàn)圖 2。經(jīng)過(guò)定量統(tǒng)計(jì)分析表明使用止血帶結(jié)扎前后雙下肢的血流相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05，見(jiàn)圖 3。

圖 3 定量分析 RIPC 前后血流量。定量分析結(jié)果顯示大鼠雙下肢使用止血帶結(jié)扎后血流顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（結(jié)扎后 vs 結(jié)扎前，#P<0.05，n=3）。2.4.2 RIPC 前后血漿中微泡數(shù)量的變化

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 王路喬;程曉曙;黃茶花;黃波;梁茜;;Rapamycin Protects Cardiomyocytes against Anoxia/Reoxygenation Injury by Inducing Autophagy through the PI3k/Akt Pathway[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2015年01期

2 夏珍;李菊香;丁浩;孫國(guó)芳;洪葵;吳延慶;程曉曙;;沉默bim的表達(dá)對(duì)缺氧所致大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響[J];中國(guó)病理生理雜志;2013年10期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 楊嬌;miR-24抑制低溫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及其機(jī)制[D];南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院;2013年

本文編號(hào)：2764272