【摘要】：目的:利用聚乙烯亞胺(PEI)對二氧化硅(Silica)表面功能化修飾,形成功能化二氧化硅納米材料載體(F-Silica),再通過靜電吸附作用與miR-24結(jié)合形成基因載體復(fù)合物F-Silica-miR-24。在體外實(shí)驗(yàn)研究中評估其對新生大鼠心室肌細(xì)胞(NRVM)的毒性及轉(zhuǎn)染效率,并篩選出最適配置比例。進(jìn)一步研究其對促凋亡蛋白Bim的表達(dá)及氧化應(yīng)激損傷后心肌細(xì)胞凋亡的影響。方法:1)構(gòu)建F-Silica,利用透射電鏡、納米粒度及Zeta電位分析儀表征材料的微觀結(jié)構(gòu)、粒徑大小及攜帶電荷。2)通過CCK-8/live-dead染色等評估F-Silica的生物相容性,瓊脂糖凝膠電泳篩選出基因復(fù)合載體F-Silica-miR-24最適配置比例。3)細(xì)胞攝取研究評估F-Silica-miR-24基因轉(zhuǎn)染效率。4)實(shí)驗(yàn)分為6組:空白對照組(NC組)單純加入100?l PBS;H_2O_2組單純加入終濃度為100?mol/L H_2O_2處理24 h;miR-24類似物(miR-24-mimics)組;miR-24類似物對照(miR-24-mimics NC)組;miR-24抑制劑(miR-24-inhibitor)組;miR-24抑制劑對照(miR-24-inhibitor NC)組在H_2O_2處理前預(yù)先加入F-Silica搭載的200 nM寡核苷酸預(yù)轉(zhuǎn)染24 h。體外轉(zhuǎn)染后通過熒光定量PCR、Western blotting等評估其對新生大鼠心室肌細(xì)胞目的基因及促凋亡蛋白Bim的作用,TUNEL染色進(jìn)一步評估其對心肌細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果:1)合成的Silica尺寸集中分布在40-60nm之間;當(dāng)Silica與DSP-PEI按照質(zhì)量比為1:1來構(gòu)建基因載體F-Silica時(shí)攜帶+21mv左右電位。2)F-Silica濃度為0.25mg/ml時(shí)可完全荷載200nM的miR-24,作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)F-Silica-miRNA組中F-Silica的終濃度;且當(dāng)以荷載miRNA所需濃度2倍劑量與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)1d/3d時(shí)對心肌細(xì)胞的活力均無明顯影響。3)細(xì)胞攝取研究清楚地證明F-Silica-miRNA復(fù)合納米載體可以有效地將miRNA分子遞送到心肌細(xì)胞中,經(jīng)計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)染效率可達(dá)80%以上。4)以100uM H_2O_2作用24h后心肌細(xì)胞存活率在50%左右,心肌細(xì)胞凋亡模型建模成功;熒光定量PCR結(jié)果示:與NC組相比,H_2O_2組、miR-24 mimics NC組、miR-24 inhibitor NC組中心肌細(xì)胞內(nèi)miR-24表達(dá)量均降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);miR-24 mimics組中miR-24的表達(dá)量顯著提高,miR-24 inhibitor組中miR-24的表達(dá)量顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Western blotting結(jié)果示:與NC組相比,H_2O_2組、miR-24 inhibitor組中蛋白Bim的表達(dá)量明顯提高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而NC組與miR-24 mimics組中蛋白Bim的表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。TUNEL染色結(jié)果表明通過體外過表達(dá)miR-24可以抑制心肌細(xì)胞凋亡,促進(jìn)心肌細(xì)胞存活;抑制miR-24的表達(dá),則心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生率顯著提升。結(jié)論:1)選用PEI800作為二氧化硅表面修飾物,合成的Silica經(jīng)DSP-PEI功能化后(W/W為1:1)生成的納米基因載體F-Silica不僅生物相容性較好且基因轉(zhuǎn)染能力更強(qiáng)。2)相比于H_2O_2組,miR-24 mimics組中miR-24的表達(dá)量顯著提高,并可顯著抑制促凋亡蛋白Bim的表達(dá)。3)F-Silica介導(dǎo)的miR-24轉(zhuǎn)染可以顯著抑制氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡,促進(jìn)心肌細(xì)胞存活。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R54

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本文編號：2760088