【摘要】：背景:分揀受體sortilin是由SORT1基因編碼,屬于囊泡分揀因子10(vacuolar protein sorting,Vps10p)結(jié)構(gòu)域受體家族的一種分揀蛋白,能夠特異性結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)胞內(nèi)蛋白底物,形成胞內(nèi)體到達(dá)胞膜或介導(dǎo)蛋白底物進(jìn)入溶酶體降解,參與包括脂質(zhì)相關(guān)蛋白在內(nèi)多種靶蛋白的表達(dá)水平與功能。研究表明,sortilin參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)和體內(nèi)血脂代謝過程,并且與動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的形成密切相關(guān)。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ATP binding cassette transporter A1,ABCA1)是一種關(guān)鍵的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,介導(dǎo)巨噬細(xì)胞膽固醇從細(xì)胞內(nèi)流出,具有抗AS作用。鑒于ABCA1在體內(nèi)脂質(zhì)代謝中的重要作用,探討sortilin是否調(diào)控ABCA1蛋白水平則顯得十分必要。本研究選取THP-1源性巨噬細(xì)胞和LDLR~(-/-)小鼠作為研究對象,旨在探討soritlin對ABCA1表達(dá)、泡沫細(xì)胞形成以及AS的影響。方法:ox-LDL孵育THP-1源性巨噬細(xì)胞,采用qRT-PCR和Western blot方法檢測不同濃度ox-LDL(0μg/mL,12.5μg/mL,25μg/mL,50μg/mL,100μg/mL)處理細(xì)胞24h后及ox-LDL處理不同時間(0h,6h,12h,24h,48h)后巨噬細(xì)胞內(nèi)sortilin mRNA和蛋白水平;高表達(dá)和沉默THP-1巨噬細(xì)胞sortilin后;液體閃爍計數(shù)儀檢測胞內(nèi)膽固醇流出情況,免疫共沉淀方法檢測sortilin與ABCA1結(jié)合情況;高效液相色譜法檢測細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量變化;油紅O染色觀察胞內(nèi)脂滴形成情況。動物實驗中,通過體視顯微鏡,蘇丹IV、HE染色、Masson三色染色、油紅O染色探討LDLR~(-/-)小鼠動脈斑塊病變情況。結(jié)果:THP-1巨噬細(xì)胞sortilin表達(dá)呈ox-LDL劑量和時間依賴性增加;并在50μg/mL ox-LDL處理24h后,THP-1巨噬細(xì)胞sortilin表達(dá)最顯著;sortilin過表達(dá)后巨噬細(xì)胞膽固醇流出減少,并下調(diào)細(xì)胞內(nèi)ABCA1蛋白水平,但對其mRNA水平無顯著影響;免疫共沉淀檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)sortilin能與ABCA1結(jié)合;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)sortilin過表達(dá)后增加THP-1巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積。并且與LV-sortilin組相比,加入溶酶體抑制劑氯喹處理后,巨噬細(xì)胞ABCA1蛋白水平明顯上調(diào),而加入蛋白酶體抑制劑MG132后,巨噬細(xì)胞細(xì)胞ABCA1蛋白水平無明顯改變。相反,使用shRNA沉默sortilin表達(dá)后,ABCA1的蛋白水平及其介導(dǎo)的膽固醇流出量明顯增加。動物實驗結(jié)果表明:轉(zhuǎn)染LV-sortilin的小鼠主動脈脂質(zhì)沉積和斑塊面積增加,并且斑塊內(nèi)ABCA1表達(dá)減少,而且在轉(zhuǎn)染LV-sortilin的基礎(chǔ)上加入LV-ABCA1或溶酶體抑制劑氯喹可逆轉(zhuǎn)這一情況。結(jié)論:sortilin能夠抑制ABCA1蛋白表達(dá)和膽固醇流出,促進(jìn)巨噬細(xì)胞泡沫化和AS的進(jìn)展。
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R543.5
【圖文】：

50 μg/ml，100 μg/ml）ox-LDL 處理 THP-1 和 Western blot 測定細(xì)胞內(nèi) sortilin mRNA 和蛋噬細(xì)胞 sortilin 表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，與空白lin mRNA 和蛋白表達(dá)均高于空白組，并且 oxrtilin mRNA 和蛋白的表達(dá)顯著增加，并且在 5胞時，sortilin mRNA 和蛋白水平達(dá)到高峰（圖巨噬細(xì)胞不同時間梯度（0h，6h，12h，24h，HP-1巨噬細(xì)胞sortilin mRNA 和蛋白表達(dá)的影依賴性方式使 sortilin mRNA 和蛋白的表達(dá)顯1 巨噬細(xì)胞 24h 時，sortilin mRNA 和蛋白表達(dá) ox-LDL 以濃度依賴和時間依賴方式上調(diào)巨，并且在 50μg/ml ox-LDL 處理 THP-1 巨噬細(xì)胞最高。

同濃度的ox-LDL處理巨噬細(xì)胞 24h后sortilin蛋白表達(dá)的變化。（*P<0.μg/ml ox-LDL 處理巨噬細(xì)胞不同時間后 sortilin mRNA 表達(dá)的變化。（p）

0μg/mlox-LDL處理巨噬細(xì)胞不同時間后sortilinmRNA表達(dá)的變化

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 周云;沃興德;;巨噬源性泡沫細(xì)胞形成過程中的機(jī)理研究及其進(jìn)展[J];生命科學(xué);2010年06期

本文編號：2759718