【摘要】：缺血性心臟病主要由于冠狀動脈粥樣硬化導(dǎo)致血管狹窄或堵塞,從而引起心臟缺血和下游組織缺氧。其中缺氧是一種存在于多種心血管疾病中的病理特征,在介導(dǎo)心臟重構(gòu)和心臟細(xì)胞的多種生物學(xué)功能方面起到重要作用,特別是缺氧能夠廣泛促進(jìn)心臟中細(xì)胞的凋亡。目前,大多數(shù)研究都關(guān)注心肌細(xì)胞的凋亡,對心臟成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblast,CF)凋亡的報道較少。然而,CF是心肌修復(fù)的關(guān)鍵因素,可以產(chǎn)生膠原蛋白,提高心臟的拉伸強(qiáng)度。纖維化修復(fù)受到破壞則會導(dǎo)致心臟壁拉伸強(qiáng)度降低。但損傷后CF的持久存在則會導(dǎo)致瘢痕、不良重塑、心肌肥大、心律失常、心力衰竭等。因此尋找抑制成熟期CF凋亡的機(jī)制研究能夠?yàn)閾p傷后的修復(fù)提供了理論依據(jù)和分子靶標(biāo)。鈣調(diào)蛋白(Calmodulin,CaM)是一種17 KDa的鈣結(jié)合蛋白,在真核細(xì)胞中廣泛存在。CaM能夠通過結(jié)合包括激酶、磷酸酶、離子通道、轉(zhuǎn)錄因子等許多靶蛋白,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞興奮-收縮耦聯(lián)、參與心率失常相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等;而CaM過度活化會導(dǎo)致心力衰竭、心肌肥大等。因此,CaM在人體尤其是心臟中至關(guān)重要。而關(guān)于CaM在CF中作用的研究較少,尚不清楚在缺氧條件下CaM對于CF的作用以及機(jī)制。鑒于鞘氨醇磷酸膽堿(Sphingosylphosphorylcholine,SPC)具有廣譜的抑凋亡功能,也具有廣泛的促自噬作用;本實(shí)驗(yàn)室之前的研究結(jié)果顯示SPC能夠通過促進(jìn)缺血模型下心肌細(xì)胞的自噬從而抑制凋亡,而且,CaM是SPC的一種受體。因此我們擬對CaM在缺氧誘導(dǎo)CF自噬與凋亡中分子機(jī)制以及SPC在CF中是否具有與心肌細(xì)胞同樣的作用等問題進(jìn)行初步研究。結(jié)果顯示,缺氧處理誘導(dǎo)CF的凋亡,用SPC處理缺氧條件下的CF,能夠促進(jìn)CF自噬,作用的靶點(diǎn)發(fā)生在自噬流。同時,SPC具有抑制CF凋亡的功能,說明在缺氧條件下SPC可能通過促進(jìn)CF自噬的方式,避免細(xì)胞進(jìn)入凋亡途徑,從而抑制CF凋亡的發(fā)生。利用siRNA干擾技術(shù),建立了干擾CaM表達(dá)的實(shí)驗(yàn)體系。發(fā)現(xiàn)干擾CaM的表達(dá)或抑制它的功能都可以增加CF的自噬而抑制其凋亡,說明CaM在CF的自噬和凋亡過程中發(fā)揮作用;SPC的功能與CaM抑制劑三氟拉嗪(Trifluoperazine,TFP)類似,同時添加SPC和TFP有疊加的效果;而SPC與Ca2+-ATPase抑制劑(能夠?qū)е录?xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高)TG的作用相反,說明SPC通過CaM參與了對CF自噬和凋亡的調(diào)控過程。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),缺氧處理會引起CF中p38和STAT3磷酸化水平增加,SPC處理CF可抑制此過程,同時伴隨著對CF凋亡的抑制。用p38抑制劑SB 253080、STAT3的抑制劑stattic以及STAT3的激動劑TFA進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn),均證明了上述結(jié)果。由此說明,SPC可通過抑制p38/STAT3的磷酸化從而抑制缺氧誘導(dǎo)的CF凋亡。另外,CaM受抑制后,p38和STAT3的磷酸化水平也下降。綜合以上結(jié)果,我們認(rèn)為SPC可能通過其受體CaM調(diào)節(jié)p38和STAT3的磷酸化,從而直接或通過增強(qiáng)自噬來抑制缺血條件下CF凋亡。SPC對CF細(xì)胞和心肌細(xì)胞作用的同質(zhì)性,為研究和將來治療缺血性心血管疾病提供了較好的材料,SPC對CF細(xì)胞具有的增強(qiáng)自噬、抑制凋亡方面的功能,也為研究心血管疾病發(fā)生后心臟重塑的分子機(jī)制提供了思路。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R541
【圖文】：

圖２邋ＳＰＣ抑制缺氧誘導(dǎo)的ＣＦ凋亡。（Ａ）分別用１、５、１０邋ｐＭ邋ＳＰＣ處理ＣＦ，移逡逑入三氣培養(yǎng)箱中缺氧４邋ｈ，普通光學(xué)顯微鏡下觀察ＣＦ形態(tài)學(xué)變化并拍照。（Ｂ）逡逑將ＣＦ按照Ａ的方法處理，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測ＰＡＲＰ１和ｃａｓｐａｓｅ３切割水平的變化。逡逑（Ｃ）按照Ａ方法處理后的細(xì)胞進(jìn)行Ｈｏｅｃｈｓｔ邋３３２５８染色，使用熒光顯微鏡拍照。逡逑Ｎｏｒ?yàn)檎l件培養(yǎng)組，Ｃｔｒ?yàn)槿毖鯇φ战M。＊Ｐ＜０．０５；邋＊＊Ｐ＜０．０１；邋＊＊＊Ｐ＜０．００１。逡逑ｎ＝３0逡逑

邋ＳＰＣ促進(jìn)ＣＦ自噬。（Ａ）分別用１、５、１０邋ｈＭ邋ＳＰＣ處理，移入三氣培養(yǎng)氧４邋１１，提蛋白使用”６切６１１１５１0１檢測１＾：３－１１表達(dá)的變化。（８）使用３－＾１八）邋ＢａｆＡｌ和ＳＰＣ共同處理，之后進(jìn)行缺氧處理，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測ＬＣ３－ＩＩ變化。ｖｅｈｉｃｌｅ邋均為溶劑對照。＊Ｐ＜０．０５；邋＊＊Ｐ＜０．０１；邋＊＊＊Ｐ＜０．００１。ｎ＝３。逡逑

圖４抑制ＣａＭ能夠抑制缺氧誘導(dǎo)的ＣＦ凋亡。（Ａ）分別使用２０、４０、６０、８０邋ｎＭ逡逑的ＣａＭ邋ｓｉＲＮＡ處理ＣＦ，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測ＣａＭ的表達(dá)量。（Ｂ）分別使用ＣａＭ逡逑的ｓｉＲＮＡ和ＳＰＣ共同處理，缺氧處理４邋ｈ，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測ＰＡＲＰ１和ｃａｓｐａｓｅ３逡逑切割水平的變化。（Ｃ）使用ＣａＭ的ｓｉＲＮＡ和ＳＰＣ共同處理之后用Ｈｏｅｃｈｓｔ邋３３２５８逡逑染色，熒光顯微鏡下觀察拍照。ｓｉＣ為ＣａＭ的ｓｉＲＮＡ，ｖｅｈｉｃｌｅ均為溶劑對照，逡逑ｎｅｇ邋為陰性對照。叩＜０．０５；邋＊叩＜０．０１；邋Ｍ＋ＰｃＯ．ＯＯｌ。ｎ＝３。逡逑

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本文編號：2759000