【摘要】：目的:探討鋅指蛋白580(ZFP580)及內(nèi)皮型一氧化氮合酶(e NOS)在異丙腎上腺素(ISO)致小鼠心肌缺血模型中的表達(dá)情況,為闡明心肌缺血疾病的發(fā)病機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1將50只雄性成年昆明小鼠隨機(jī)分為5組,(1)對(duì)照組;(2)ISO,0.25mg/kg組,(3)ISO,1mg/kg組,(4)ISO,2.5mg/kg組,(5)ISO,5mg/kg組,每組10只。行ISO小鼠腹腔注射,在小鼠腹腔注射ISO后5分鐘,采用BL-420生物功能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),對(duì)參與試驗(yàn)的小鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖進(jìn)行記錄,當(dāng)發(fā)現(xiàn)波形于ST段抬高,T波高聳,表現(xiàn)為典型心肌缺血心電圖波形,證明造模成功,繼而進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn);處死小鼠前行摘眼球放血并收集血液,對(duì)照組小鼠腹腔注射等量生理鹽水后同法處死。2收集小鼠血清行生化指標(biāo)監(jiān)測(cè):主要生化指標(biāo)包括LDH及和CK活性數(shù)據(jù)。采用3000r/min對(duì)血清進(jìn)行離心處理,并利用分光光度計(jì)對(duì)上述兩項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。3心肌組織形態(tài)學(xué)指標(biāo)檢查:對(duì)采集到的心尖部位組織進(jìn)行固定、脫水、包埋處理,利用對(duì)所制組織切片進(jìn)行觀察,獲取缺血心肌在形態(tài)上的變化情況。4定量RT-PCR檢測(cè)ZFP580m RNA及e NOS的表達(dá):通過對(duì)Trizol試劑的有效利用,完成對(duì)心肌中總RNA的提取工作。取所獲取的定量總RNA(400μg)10μl體系,經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄形成c DNA第一鏈。對(duì)c DNA模板(10μl)進(jìn)行簡(jiǎn)單處理后,再與靶基因ZFP580上下游引物融合,采用PCR對(duì)50μl體系進(jìn)行反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參照,監(jiān)測(cè)ZFP580及e NOS基因的相對(duì)表達(dá)量。5心肌組織的染色觀察:對(duì)心肌組織進(jìn)行HE和免疫組織化學(xué)染色操作,并于顯微鏡下對(duì)著色情況進(jìn)行觀察。對(duì)其中陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),最低計(jì)數(shù)200個(gè)心肌細(xì)胞,以陽性細(xì)胞占視野內(nèi)心肌細(xì)胞總數(shù)的百分比表示陽性率。載玻片陽性率取平均值。陰性對(duì)照:用0.01mol/L PBS代替一抗,其余步驟基本相同。6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:全部試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,應(yīng)用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(初步數(shù)據(jù)分析采用excel分析)。采用單因素方差表示組間差異,其中顯著性差異者用Student-Newmen-Kuels q檢驗(yàn),并進(jìn)行兩兩比較。結(jié)果:1 ISO對(duì)小鼠ECG中ST段、T波及血清LDH、CK活性的影響完成對(duì)小鼠的ISO腹腔注入后,小鼠表現(xiàn)為ST、T段抬升,表明小鼠出現(xiàn)典型的心肌缺血ECG改變,即模型制備成功。模型組小鼠LDH、CK活性兩項(xiàng)指標(biāo),較對(duì)照組有明顯提升(P0.5)2 ISO對(duì)小鼠心肌形態(tài)學(xué)的影響對(duì)心肌的形態(tài)學(xué)觀察,Masson染色顯示對(duì)照組心肌細(xì)胞排列整齊,心肌免疫反應(yīng)著色為黃色。完成ISO注入后的實(shí)驗(yàn)組小鼠心肌細(xì)胞排列相對(duì)紊亂,心肌多處呈現(xiàn)不規(guī)則壞死灶,并有明顯的炎癥細(xì)胞侵潤表現(xiàn)。缺血心肌染色為紅色。HE染色可見缺血心肌細(xì)胞核皺縮不規(guī)則,發(fā)生空泡樣變性。3小鼠缺血心肌細(xì)胞ZFP580m RNA及e NOS的表達(dá)鋅指基因ZFP580及e NOS在心肌缺血損傷中表達(dá)均降低,提示ZFP580及e NOS在心肌缺血發(fā)揮了某種調(diào)控功能,對(duì)心肌起保護(hù)作用。同時(shí),研究結(jié)果顯示ISO可能影響心肌細(xì)胞中ZFP580的轉(zhuǎn)錄及其翻譯,其具體機(jī)制尚不完全明確。4小鼠缺血心肌細(xì)胞ZFP580蛋白及e NOS蛋白的表達(dá)ZFP580定位于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中,黃色染色細(xì)胞代表陽性反應(yīng)細(xì)胞,在實(shí)驗(yàn)組小鼠心肌的ZFP580陽性細(xì)胞比例較對(duì)照組明顯偏低。e NOS蛋白均以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞,與對(duì)照組相比也明顯偏低。結(jié)論:ZFP580及e NOS在異丙腎上腺素致小鼠心肌缺血模型中的表達(dá),隨心肌缺血性損傷而降低。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R542.2;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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