【摘要】：目的:動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)導(dǎo)致的冠心病嚴(yán)重威脅人類健康。大量研究表明:AS是一個血管內(nèi)壁受損之后發(fā)生的一系列慢性炎性反應(yīng)的過程,同其他炎癥性疾病一樣,炎性反應(yīng)在AS發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用,貫穿于AS的各個病變過程。在AS炎癥中發(fā)揮重要作用的炎性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)中的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1是細胞焦亡(一種新發(fā)現(xiàn)的程序性死亡方式)的關(guān)鍵分子,我們推測AS病變過程與細胞焦亡有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)AS發(fā)生發(fā)展的重要誘因氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)會造成細胞骨架F-actin的微絲斷裂、排列紊亂,甚至缺失。F-actin的結(jié)合蛋白NEXN在AS斑塊中表達增高,但機制不明。本研究擬從細胞焦亡角度,用OX-LDL刺激細胞建立的細胞模型探討NEXN在AS病理過程中發(fā)揮的作用及機制,為闡明AS病理機制提供實驗依據(jù)。方法:在動脈粥樣硬化形成過程中,沉積在動脈粥樣硬化斑塊里的細胞主要為:內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、平滑肌細胞。因此課題選用人急性單核巨噬細胞白血病細胞(THP-1)進行研究。1.OX-LDL誘導(dǎo)THP-1細胞發(fā)生細胞焦亡1.1 OX-LDL誘導(dǎo)的THP-1細胞焦亡檢測用脂多糖(LPS)以及氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)分別先后誘導(dǎo)THP-1細胞之后,通過EB(Ethidium bromide,溴化乙錠)、EthD-2染色檢測細胞pyroptosis發(fā)生率、通過乳酸脫氫酶(LDH)釋放實驗檢測細胞毒性以及通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測焦亡相關(guān)分子Caspase-1、IL-1β表達情況。蛋白免疫印跡(western blot,WB)檢測活性caspase-1:Caspase-1 P10表達情況。1.2細胞焦亡抑制實驗用Caspase-1抑制劑Z-YVAD-FMK處理THP-1細胞之后通過EB、EthD-2染色檢測細胞pyroptosis發(fā)生率。2.在OX-LDL誘導(dǎo)THP-1細胞中NEXN對細胞焦亡的作用2.1 NEXN在OX-LDL誘導(dǎo)THP-1細胞中細胞焦亡時的表達情況用脂多糖(LPS)以及氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)分別處理THP-1之后,檢測細胞pyroptosis發(fā)生率、乳酸脫氫酶釋放(LDH)、NEXN、焦亡相關(guān)分子:Caspase-1、IL-1β表達情況。2.2在OX-LDL誘導(dǎo)THP-1細胞中siRNA干擾NEXN后檢測細胞焦亡情況為了進一步探討在OX-LDL誘導(dǎo)THP-1細胞焦亡時表達增高的NEXN對細胞焦亡的作用,我們在THP-1建立的OX-LDL誘導(dǎo)THP-1細胞中干擾NEXN,檢測細胞pyroptosis發(fā)生率、乳酸脫氫酶釋放(LDH)、NEXN、焦亡相關(guān)分子:Caspase-1、IL-1β表達情況。2.3在OX-LDL誘導(dǎo)THP-1細胞中過表達NEXN后檢測細胞焦亡情況為了進一步明確NEXN在AS中對細胞焦亡的作用,我們在OX-LDL誘導(dǎo)的THP-1細胞中過表達NEXN,檢測細胞pyroptosis發(fā)生率、乳酸脫氫酶釋放(LDH)、NEXN、焦亡相關(guān)分子:Caspase-1、IL-1β表達情況。結(jié)果:1.用40mg/ml濃度的OX-LDL誘導(dǎo)THP-1細胞后,OX-LDL的細胞焦亡發(fā)生率比control組高15%。2.OX-LDL誘導(dǎo)THP-1細胞細胞焦亡相關(guān)分子Caspase-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平是control組的2.74±0.32倍、IL-1βmRNA轉(zhuǎn)錄水平是control組的2.71±0.46倍,其蛋白表達水平也出現(xiàn)均不同程度的增高。3.OX-LDL誘導(dǎo)THP-1細胞中用Caspase-1抑制劑抑制細胞焦亡后,細胞焦亡發(fā)生率降低22%。4.在OX-LDL誘導(dǎo)THP-1細胞中細胞焦亡時,NEXN mRNA轉(zhuǎn)錄水平是control組的8.31±1.46倍,其蛋白表達水平也增高。5.在OX-LDL誘導(dǎo)THP-1細胞中siRNA干擾NEXN后,細胞焦亡發(fā)生率比siNC組升高35%,LDH比siNC組升高12.6%,IL-1β比siNC組升高28.6ng/ml,cleaved caspase-1蛋白表達量也增高。6.在OX-LDL誘導(dǎo)THP-1細胞中過表達NEXN后,細胞焦亡發(fā)生率比空載體組降低14%,LDH比空載體組降低29.8%,IL-1β比空載體組降低20.2ng/ml,cleaved caspase-1蛋白表達量也降低。結(jié)論:1.在OX-LDL誘導(dǎo)THP-1細胞中,細胞焦亡存在并發(fā)揮重要作用。2.在OX-LDL誘導(dǎo)THP-1細胞中,過表達NEXN,細胞焦亡減少;干擾NEXN的轉(zhuǎn)錄,細胞焦亡增加;說明了NEXN可能通過Caspase-1參與細胞焦亡的過程,NEXN可能對TP細胞焦亡有抑制作用。
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R543.5
【圖文】：

EB及EthD-2染色細胞

EB/EthD-2染色檢測（200×）：該圖顯示的是各組細胞EB、EthD-2染色結(jié)果

.8.3.5 抗體孵育：將 pvdf 膜用 PBST 清洗 3 遍，每次 10min，緩慢輕搖，之抗中，4℃冰箱過夜。.8.3.6 將 PVDF 膜用 PBST 清洗三遍每次 10min，緩慢輕搖，加入二抗，室溫PBST 清洗 2 次，每次 10ml，緩慢輕搖。暗室中加入 ECL 發(fā)光液，顯影液中顯定影 2-5min。.9 統(tǒng)計分析 IBM SPSS Statistics 19 統(tǒng)計軟件進行處理，實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差統(tǒng)計學(xué) P＜0.05 為有統(tǒng)計學(xué)意義。 OX-LDL 誘導(dǎo)的 THP-1 的細胞發(fā)生細胞焦亡的同時 NEXN 的基因及蛋白水平均 結(jié)果顯示 OX-LDL 處理組的 caspase-1 mRNA 相對表達量是 control 組 2.74±IL-1β mRNA 相對表達量 OX-LDL 處理組是 control 組的 2.71±0.46 倍，NEXN對表達量 OX-LDL 處理組是 control 組的的 8.31±1.46 倍（P＜0.05）；western顯示 OX-LDL 誘導(dǎo)的 THP-1 細胞的 NEXN 蛋白表達量比 control 組增高。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 劉建民;張榮偉;袁紹紀(jì);;頸動脈粥樣硬化斑塊形成原因的研究進展[J];實用醫(yī)藥雜志;2009年02期

2 陳玉成,梁玉佳,劉瑞,黃明慧,曾智;氧化低密度脂蛋白對血管內(nèi)皮細胞骨架的損傷及其機制[J];心血管康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志;2004年04期

本文編號：2756164