【摘要】：背景與目的急性心肌梗死、心臟缺血再灌注和氧化應(yīng)激等病理因素是引起心肌細(xì)胞凋亡的重要誘因。細(xì)胞凋亡的線粒體途徑在控制細(xì)胞信號(hào)誘導(dǎo)凋亡的存活和死亡之間起主導(dǎo)作用。線粒體凋亡信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者Bcl-2家族蛋白能調(diào)節(jié)m PTP的開合。Bcl-2/Bax比值能夠體現(xiàn)二者對(duì)細(xì)胞凋亡的實(shí)際調(diào)控作用。mi RNAs是真核生物的一種內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA,可識(shí)別靶基因m RNA的3’UTR相應(yīng)序列從而調(diào)控基因表達(dá)。mi R-29家族由mi R-29a、mi R-29b和mi R-29c組成,它們主要在心肌成纖維細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)。Cx43是心室工作肌細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)最主要的連接蛋白,主要存在于心房和心室肌組織中,參與了心臟發(fā)育及相關(guān)疾病的病理生理過程。在TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中,TGF-β是強(qiáng)而有力的致纖維化細(xì)胞因子,也是成纖維細(xì)胞強(qiáng)趨化因子,可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化,刺激膠原蛋白、纖維連接蛋白及蛋白多糖等細(xì)胞間質(zhì)的合成。在心肌梗死后,mi R-29表達(dá)的下調(diào),使心肌纖維化增強(qiáng)。但mi R-29b1在缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中的作用尚未清楚。因此,本研究擬利用體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞在三氣培養(yǎng)箱的缺氧條件下模擬體內(nèi)心肌細(xì)胞缺血缺氧狀態(tài),探索mi R-29b1在缺氧心肌細(xì)胞損傷中的作用。并且采用人源和大鼠源兩種心肌細(xì)胞來觀察是否有差別,旨在為下一步動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備,并且為臨床缺血性心臟病提供新的診斷和治療靶點(diǎn)。方法第一章過表達(dá)mi R-29b1減少缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率構(gòu)建體外心肌細(xì)胞AC16和H9C2細(xì)胞缺氧模型來模擬體內(nèi)心肌細(xì)胞缺血缺氧狀態(tài)。缺氧條件為1%O2、37℃,24和48小時(shí)。心肌細(xì)胞分組后分別轉(zhuǎn)染mi R-29b1mimic和Negative Control常規(guī)培養(yǎng)48h以確保其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。流式細(xì)胞術(shù)檢測AC16和H9C2心肌細(xì)胞凋亡。第二章過表達(dá)mi R-29b1的心肌細(xì)胞上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax比值及Caspase-3和Caspase-9蛋白的表達(dá)Western blot檢測各組心肌細(xì)胞中Bcl-2,Bax,Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)變化。第三章缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞過表達(dá)mi R-29b1下調(diào)Cx43蛋白表達(dá),上調(diào)TGF-β蛋白表達(dá)Western blot檢測各組心肌細(xì)胞中Cx43和TGF-β蛋白表達(dá)變化。結(jié)果第一章過表達(dá)mi R-29b1減少缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率流式細(xì)胞術(shù)顯示心肌細(xì)胞AC16和H9C2均可因缺氧產(chǎn)生凋亡,且細(xì)胞凋亡率隨著缺氧時(shí)間延長而增加。成功轉(zhuǎn)染mi R-29b1 mimic和Negative Control進(jìn)入AC16和H9C2心肌細(xì)胞后,流式細(xì)胞術(shù)分析顯示細(xì)胞凋亡率在轉(zhuǎn)染mi R-29b1之后顯著降低。第二章過表達(dá)mi R-29b1的心肌細(xì)胞上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax比值及Caspase-3和Caspase-9蛋白的表達(dá)Western blot結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)染mi R-NC的相比,AC16細(xì)胞在轉(zhuǎn)染mi R-29b1后Bcl-2/Bax表達(dá)輕度增加,Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)明顯增加。H9C2細(xì)胞過表達(dá)mi R-29b1后Bcl-2/Bax較單純?nèi)毖鹾娃D(zhuǎn)染mi R-NC的有所下降,Caspase-3蛋白表達(dá)與轉(zhuǎn)染mi R-NC的相差無幾而Caspase-9蛋白表達(dá)有所增加。第三章缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞過表達(dá)mi R-29b1下調(diào)Cx43蛋白表達(dá),上調(diào)TGF-β蛋白表達(dá)Western blot結(jié)果表明,AC16和H9C2細(xì)胞中的Cx43在缺氧環(huán)境下的表達(dá)均較空白對(duì)照組降低,轉(zhuǎn)染mi R-29b1前后都沒有變化;而兩種心肌細(xì)胞mi R-29b1組TGF-β的表達(dá)雖然比空白對(duì)照組的有所降低,但相比于單純?nèi)毖踅M和mi R-NC組TGF-β的表達(dá)均有明顯增加。結(jié)論1.缺氧可誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡,且隨著缺氧時(shí)間延長細(xì)胞凋亡率增加;過表達(dá)mi R-29b1能夠顯著降低缺氧條件下心肌細(xì)胞的凋亡率。2.過表達(dá)mi R-29b1能夠通過線粒體凋亡通路抑制缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。3.過表達(dá)mi R-29b1的缺氧心肌細(xì)胞中Cx43蛋白表達(dá)無明顯變化,TGF-β蛋白表達(dá)顯著增加。4.人和大鼠心肌細(xì)胞在缺氧誘導(dǎo)下產(chǎn)生凋亡的途徑及受到抑制的方式表現(xiàn)出一致性。
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R54
【圖文】：

24圖 1.流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞在不同缺氧時(shí)間下的凋亡率。A, AC16 細(xì)胞的空白對(duì)照組（Ctrl24h）；B,AC16 細(xì)胞的單純?nèi)毖踅M（SGOD24h）：1%O2、37℃、24h；C,AC16 細(xì)胞的空白對(duì)照組（Ctrl48h）；D,AC16 細(xì)胞的單純?nèi)毖踅M（SGOD48h）：1%O2、37℃、48h；E,AC16 細(xì)胞凋亡率隨著缺氧時(shí)間延長而增加。F, H9C2 細(xì)胞的空白對(duì)照組（Ctrl 24h）；G, H9C2 細(xì)胞的單純?nèi)毖踅M（SGOD 24h）：1%O2、37℃、24h；H, H9C2 細(xì)胞的空白對(duì)照組（Ctrl48h）；I, H9C2 細(xì)胞的單純?nèi)毖踅M（SGOD 48h）：1%O2、37℃、48h；J, H9C2 細(xì)胞凋亡率隨著缺氧時(shí)間延長而增加。P * < 0.05 與 Ctrl24h 組相比，P # < 0.05 與 SGOD24h 組相比。1.3.2.過表達(dá) miR-29b1 減少缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率如圖 2 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，人源心肌細(xì)胞 AC16 在三氣培養(yǎng)箱內(nèi)缺氧培養(yǎng)

26圖 2.流式細(xì)胞儀檢測各分組心肌細(xì)胞的凋亡率。A, AC16 細(xì)胞空白對(duì)照組（Ctrl48h）；B, AC16細(xì)胞單純?nèi)毖踅M（SGOD48h）；C, AC16 細(xì)胞 miR-NC 組；D, AC16 細(xì)胞 miR-29b1 組；E, 過表達(dá) miR-29b1 抑制缺氧誘導(dǎo)的 AC16 細(xì)胞凋亡。F, H9C2 細(xì)胞空白對(duì)照組（Ctrl48h）；G, H9C2 細(xì)胞單純?nèi)毖踅M（SGOD48h）；H, H9C2 細(xì)胞 miR-NC 組；I, H9C2 細(xì)胞 miR-29b1 組；J, 過表達(dá)miR-29b1 抑制缺氧誘導(dǎo)的 H9C2 細(xì)胞凋亡。P * < 0.05，與空白對(duì)照組對(duì)比，P # < 0.05,與單純?nèi)毖踅M對(duì)比。

第二章 過表達(dá)miR-29b1的心肌細(xì)胞上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax比值及 Caspase-3和Cas蛋白的表達(dá)雖然比空白對(duì)照組和單純?nèi)毖踅M的 Bcl-2/Bax 略小，但是比 miR-NC 組的有所增在 H9C2 細(xì)胞中，單純?nèi)毖踅M和 miR-NC 組的 Bcl-2/Bax 均比空白對(duì)照組的比值而且 miR-29b1 組的 Bcl-2/Bax 更小。以上結(jié)果說明，miR-29b1 可以增加 AC16細(xì)胞由于轉(zhuǎn)染試劑的細(xì)胞毒性造成的凋亡中Bcl-2/Bax的表達(dá)，但是不能夠完全缺氧造成的凋亡或者恢復(fù)為正常生理狀態(tài)；在 H9C2 細(xì)胞中 miR-29b1 轉(zhuǎn)染之Bcl-2/Bax 減少得更加嚴(yán)重，顯示出了種屬源性的不一致。據(jù)此我們推測 miR抑制缺氧后心肌細(xì)胞凋亡的效果在人源心肌細(xì)胞中更為顯著。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王健,劉興鵬,劉小青,龍德勇,董建增,馬長生;持續(xù)快速心房起搏對(duì)犬肺靜脈及心房組織連接蛋白43和Ⅲ型膠原的影響[J];中華心血管病雜志;2005年03期

本文編號(hào)：2752475