【摘要】：目的:急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)已經(jīng)成為了當(dāng)今世界上最嚴(yán)重且死亡率最高的疾病之一,隨著當(dāng)前人們生活方式的變化,導(dǎo)致AMI發(fā)病率仍每年呈上升趨勢(shì)。目前最有效的治療方法就是通過(guò)經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous transluminal coronary intervention,PCI)盡可能快的恢復(fù)心肌血液再灌注。但是再灌注本身也帶來(lái)了許多副作用,缺血能引起心肌超微結(jié)構(gòu),能量代謝功能和電生理一系列損傷,該損傷在血管再通后表現(xiàn)得更為突出,甚至導(dǎo)致嚴(yán)重的心律失常最終造成心源性猝死。這種情況被稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)。MIRI的發(fā)生比較復(fù)雜,多種機(jī)制涉及其中,比如細(xì)胞內(nèi)氧自由基的大量產(chǎn)生,鈣離子超負(fù)荷,白細(xì)胞的炎癥作用以及高能磷酸化合物缺乏,細(xì)胞凋亡等。在再灌注后心肌中,心肌細(xì)胞存活的數(shù)量直接影響到后續(xù)的心臟功能和生活質(zhì)量,而MIRI后引起的細(xì)胞凋亡嚴(yán)重減少活性的心肌細(xì)胞,可以導(dǎo)致再灌注后心功能進(jìn)一步惡化。所以關(guān)注如何減少M(fèi)IRI引起的細(xì)胞凋亡也成為了重要的研究課題。研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血預(yù)處理和后處理能夠有效的改善MIRI,但是在臨床操作中涉及到倫理道德問(wèn)題,故可行性不佳,而探索有效的藥物干預(yù)手段來(lái)阻止心肌細(xì)胞凋亡成為預(yù)防MIRI的一個(gè)重要突破口。二甲雙胍(metformin)作為一種雙胍衍生物,是一種傳統(tǒng)的降血糖藥。但是近年來(lái)該藥越來(lái)越多的藥物多效性被挖掘出來(lái),包括抗炎,抗氧化,保護(hù)內(nèi)皮功能,減少血栓形成,抗心肌凋亡等。其在糖尿病伴有MIRI中抗心肌細(xì)胞凋亡作用已經(jīng)有報(bào)道,比如通過(guò)激活A(yù)MPK通路減少心肌細(xì)胞凋亡。但是二甲雙胍對(duì)對(duì)MIRI保護(hù)多表現(xiàn)在患有糖尿病或代謝綜合征患者中,而針對(duì)單純MIRI的保護(hù)作用臨床上仍有爭(zhēng)議,其中的機(jī)制探討也未完全明確,故二甲雙胍作為一種廉價(jià)、安全及廣泛運(yùn)用的降血糖藥物值得進(jìn)一步探討其抗心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制。前列腺六次跨膜上皮抗原4(six-transmembrane epithelial antigen of prostate 4,STEAP4),最初發(fā)現(xiàn)其可誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞分化,并促進(jìn)脂肪細(xì)胞吸收葡萄糖,影響細(xì)胞能量代謝以及抗凋亡。二甲雙胍被證實(shí)增加人CD34~+細(xì)胞在缺氧條件下的STEAP4的表達(dá)量。近期發(fā)現(xiàn)STEAP4在心功能障礙患者中明顯減少,具有顯著相關(guān)性。因此我們假設(shè)STEAP4可能在二甲雙胍保護(hù)MIRI導(dǎo)致凋亡的過(guò)程中起到了一定的作用,最終減輕MIRI誘導(dǎo)的凋亡,保護(hù)心臟功能。總而言之,本課題旨在探討二甲雙胍對(duì)心肌缺血再灌注損傷的影響。將SD大鼠和H9c2細(xì)胞當(dāng)成本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象,通過(guò)建立SD大鼠在體缺血再灌注損傷模型及H9c2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型,探討下面兩方面內(nèi)容:(1)觀察并分析二甲雙胍預(yù)處理組在大鼠缺血再灌注損傷后是否對(duì)MIRI擁有保護(hù)作用;(2)應(yīng)用RNA干擾技術(shù)低表達(dá)STEAP4的水平,觀察二甲雙胍對(duì)H9c2細(xì)胞缺氧復(fù)氧的保護(hù)作用,探討二甲雙胍發(fā)揮心肌保護(hù)作用的可能機(jī)制。研究方法:第一部分:本研究采用SD大鼠進(jìn)行如下在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1、將60只雄性且健康的SD大鼠隨機(jī)平均分成3組:(A)對(duì)照組(Control);(B)缺血再灌注組(ischemia reperfusion,I/R);(C)缺血再灌注+二甲雙胍組(I/R+metformin)。C組的大鼠在缺血再灌注14天前根據(jù)老鼠體重按照250mg/kg的標(biāo)準(zhǔn),將二甲雙胍溶解于100μl生理鹽水中進(jìn)行腹腔內(nèi)注射,每天一次。A組和B組注射同體積的生理鹽水,同樣每天一次,連續(xù)注射14天。B組和C組通過(guò)采用開胸結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支半小時(shí),再灌注2小時(shí)的方法建立缺血再灌注模型。A組大鼠同樣需要開胸及冠狀動(dòng)脈左前降支穿線,但不結(jié)扎及進(jìn)行后續(xù)操作。2、大鼠心臟冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎后通過(guò)觀察及分析心電圖II導(dǎo)聯(lián)ST段的變化判斷心肌缺血模型是否建立成功,為后續(xù)心臟再灌注做準(zhǔn)備。3、在心臟再灌注結(jié)束后,收集各組大鼠血清并通過(guò)ELISA法檢測(cè)肌鈣蛋白(troponin)及肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量鑒定心臟的損傷程度。4、通過(guò)TTC染色法明確SD大鼠缺血再灌注后心梗面積。5、通過(guò)原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)染色衡量心肌細(xì)胞的凋亡程度。6、采用蘇木素伊紅染色(hematoxylin and eosin,HE)評(píng)價(jià)心肌病理變化和損傷。第二部分:本研究采用體外培養(yǎng)H9c2細(xì)胞進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):1、建立心肌缺氧復(fù)氧模型:將正常狀態(tài)(37℃、5%CO_2)下培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞隨機(jī)分成6組:(A)對(duì)照組(Control);(B)缺氧復(fù)氧組(hypoxia-reoxygenation,H/R),用Earle’s培養(yǎng)液(無(wú)血清及葡萄糖)替換正常培養(yǎng)基并放入缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37℃、5%CO_2、94%N_2)6小時(shí),隨后將Earle’s培養(yǎng)液換成正常培養(yǎng)基放入正常條件下(37℃、5%CO_2)培養(yǎng)4小時(shí)。(C)缺氧復(fù)氧+二甲雙胍(10μM)組(H/R+metformin(10μM)),將二甲雙胍溶解于培養(yǎng)基加入細(xì)胞培養(yǎng)板,二甲雙胍(10μM)預(yù)處理細(xì)胞12小時(shí)后再進(jìn)行缺氧復(fù)氧。(D)缺氧復(fù)氧+二甲雙胍(20μM)組(H/R+metformin(20μM)),操作同C組。(E)缺氧復(fù)氧+二甲雙胍(40μM)組(H/R+metformin(40μM)),操作同C組。(F)缺氧復(fù)氧+二甲雙胍(80μM)組(H/R+metformin(80μM)),操作同C組。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞活性以及蛋白免疫印跡檢測(cè)各組Bcl-2/Bax比例分析各組凋亡情況,確定二甲雙胍預(yù)處理的最適作用濃度,以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2、將正常狀態(tài)(37℃、5%CO_2)下培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞隨機(jī)分成5組:(A)對(duì)照組(Control),不進(jìn)行任何處理;(B)缺氧復(fù)氧組(hypoxia-reoxygenation,H/R),用Earle’s培養(yǎng)液替換正常培養(yǎng)基,并放入缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37℃、5%CO_2、94%N_2)6小時(shí),隨后將Earle’s培養(yǎng)液換成正常培養(yǎng)基放入正常條件下(37℃、5%CO_2)培養(yǎng)4小時(shí)。(C)缺氧復(fù)氧+二甲雙胍組(H/R+metformin),將二甲雙胍溶解于培養(yǎng)基加入細(xì)胞培養(yǎng)板,預(yù)處理細(xì)胞12小時(shí)后再進(jìn)行缺氧復(fù)氧。(D)缺氧復(fù)氧+siNC+二甲雙胍組(H/R+siNC+metformin),H9c2細(xì)胞瞬轉(zhuǎn)siRNA NC,轉(zhuǎn)染24小時(shí)后進(jìn)行C組的處理。(E)缺氧復(fù)氧+siSTEAP4+二甲雙胍組(H/R+siSTEAP4+metformin)H9c2細(xì)胞瞬轉(zhuǎn)STEAP4 siRNA,轉(zhuǎn)染24小時(shí)后進(jìn)行C組的處理。2、臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)定H9c2細(xì)胞生存率。3、流式細(xì)胞術(shù)衡量H9c2細(xì)胞凋亡率。4、羅丹明123(Rh123)染色測(cè)定H9c2細(xì)胞線粒體膜電位變化。5、Real Time PCR檢測(cè)STEAP4及凋亡相關(guān)分子(Bcl-2、Bax)的mRNA表達(dá)水平。6、蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞和H9c2細(xì)胞的凋亡相關(guān)分子(Bcl2、Bax),線粒體凋亡相關(guān)分子(Cytochrome C、Cleaved Caspase9、Cleaved Caspase3),STEAP4以及PPAR-γ的表達(dá)情況。結(jié)果:1、各組心肌缺血再灌注大鼠的心電圖II導(dǎo)聯(lián)ST段在結(jié)扎后明顯高于對(duì)照組。再灌注后大鼠心肌梗死相關(guān)標(biāo)志蛋白CK-MB、troponin相較于對(duì)照組上升明顯,而當(dāng)二甲雙胍預(yù)處理后這幾個(gè)指標(biāo)均有明顯下降。2、各組心肌缺血再灌注大鼠心梗面積和細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組,而給與二甲雙胍預(yù)處理組的心臟梗死面積及細(xì)胞凋亡率明顯下降。3、缺血再灌注的大鼠心肌有纖維化形成,細(xì)胞間質(zhì)水腫、炎癥細(xì)胞浸入等病理變化,給與二甲雙胍后可改善心肌損傷和緩解心肌病理改變。4、在缺血再灌注的大鼠中,STEAP4表達(dá)較正常組減少,同時(shí)促凋亡蛋白(Bax)表達(dá)增加,抗凋亡蛋白(Bcl-2)減少,而給與二甲雙胍預(yù)處理后,逆轉(zhuǎn)了這種情況。5、在H9c2細(xì)胞中我們發(fā)現(xiàn)二甲雙胍40μM濃度時(shí)最能改善缺氧復(fù)氧損傷細(xì)胞狀態(tài)。在H9c2細(xì)胞中我們同樣發(fā)現(xiàn)和缺氧復(fù)氧組對(duì)比,二甲雙胍預(yù)處理有改善缺氧復(fù)氧損傷作用,包括提升細(xì)胞生存率,減少細(xì)胞凋亡率,增加Bcl-2表達(dá),減少Bax水平,增加STEAP4、PPAR-γ表達(dá)量,減少線粒體凋亡分子(Cytochrome C、Cleaved Caspase9、Cleaved Caspase3)表達(dá)水平,增加線粒體膜電位。6、當(dāng)敲低STEAP4蛋白表達(dá)后部分逆轉(zhuǎn)了二甲雙胍對(duì)H9c2細(xì)胞在缺氧復(fù)氧下的保護(hù)作用,表現(xiàn)為抗凋亡蛋白(Bcl-2)下降,促凋亡蛋白(Bax)表達(dá)增加,PPAR-γ水平下降,線粒體膜電位下降以及線粒體相關(guān)凋亡相關(guān)分子(Cytochrome C、Cleaved Caspase9、Cleaved Caspase3)的激活。結(jié)論:1、二甲雙胍可以有效減輕大鼠心肌細(xì)胞凋亡并改善心肌缺血再灌注損傷。2、二甲雙胍可以改善H9c2細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷,抑制線粒體凋亡,激活STEAP4及PPAR-γ表達(dá)。因此,STEAP4/PPAR-γ相關(guān)的信號(hào)通路可能是二甲雙胍對(duì)心血管系統(tǒng)多效性保護(hù)途徑的一種新的解釋。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R542.22
【圖文】：

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文，繪制偏倚風(fēng)險(xiǎn)圖，見圖 2。雙胍治療與格列美脲治療糖尿病比較急性心肌梗死發(fā)病獻(xiàn)比較了二甲雙胍與格列美脲治療糖尿病后 AMI 發(fā)病率，其 95（relative risk）可信區(qū)間是 0.71（0.57,0.88）。各研究中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)異%，P=0.25），采用固定效應(yīng)模型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.002）表明：二甲雙胍治療比格列美脲治療糖尿病后急性心梗發(fā)病率低

納入研究的風(fēng)險(xiǎn)偏倚圖

治療前后的AMI患病率森林圖

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本文編號(hào)：2752063