【摘要】：第一部分無(wú)呼吸機(jī)支持下微創(chuàng)小鼠主動(dòng)脈弓縮窄心力衰竭模型的建立目的:主動(dòng)脈弓縮窄(transverse aortic constriction,TAC)心力衰竭模型由于具有構(gòu)建時(shí)間短、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于壓力超負(fù)荷所致心力衰竭的研究。以往多在氣管插管機(jī)械通氣下建立這一動(dòng)物模型,但小鼠氣管插管耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng),反復(fù)嘗試容易造成氣道損傷;且經(jīng)典TAC手術(shù)創(chuàng)傷較大,小鼠死亡率較高。為了減少氣道損傷和手術(shù)創(chuàng)傷導(dǎo)致的小鼠死亡,本研究擬采用不需氣管插管,經(jīng)面罩吸入麻醉及微創(chuàng)手術(shù)方式建立TAC模型,以降低模型構(gòu)建過(guò)程中的小鼠死亡率。方法:1、3月齡c57小鼠為研究對(duì)象,分為假手術(shù)組、機(jī)械通氣TAC組和非機(jī)械通氣TAC組建立小鼠TAC模型。機(jī)械通氣TAC組在氣管插管機(jī)械通氣下,采用經(jīng)典TAC手術(shù)方式;非機(jī)械通氣TAC組保留自主呼吸,采用微創(chuàng)TAC手術(shù)方式;假手術(shù)組同非機(jī)械通氣TAC組,不同點(diǎn)在于手術(shù)過(guò)程中不對(duì)主動(dòng)脈弓進(jìn)行環(huán)縮;2、假手術(shù)組、機(jī)械通氣TAC組和非機(jī)械通氣TAC組小鼠術(shù)前及術(shù)后3天,利用高頻超聲檢測(cè)主動(dòng)脈弓直徑、血流速度和壓差;術(shù)前及術(shù)后4周,利用超聲心動(dòng)圖心動(dòng)圖檢測(cè)LVAWd、LVIDd及LVPWd并計(jì)算LVEF值;術(shù)后4周取小鼠左心室心肌組織,HE染色后使用顯微鏡對(duì)心肌超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察;3、假手術(shù)組和非機(jī)械通氣TAC組術(shù)前及術(shù)后8周利用超聲心動(dòng)圖檢測(cè)LVAWd、LVIDd及LVPWd并計(jì)算LVEF值,術(shù)后8周測(cè)量LW和BW,計(jì)算LW/BW值。結(jié)果:1、非機(jī)械通氣TAC組操作時(shí)間為10.86±2.36分鐘較機(jī)械通氣TAC組24.44±3.55分鐘明顯減少(p0.05);小鼠存活率增加,兩組分別為93.3%和73.3%(p0.05);2、假手術(shù)組、機(jī)械通氣TAC組和非機(jī)械通氣TAC組術(shù)前主動(dòng)脈弓直徑、血流速度和壓差、LVAWd、LVIDd、LVPWd、和LVEF組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;術(shù)后3天或4周,機(jī)械通氣TAC組和非機(jī)械通氣TAC組上述指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),而與自身術(shù)前及假手術(shù)組術(shù)后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);比較假手術(shù)組,機(jī)械通氣TAC組和非機(jī)械通氣TAC組心肌細(xì)胞增大(p0.05);3、術(shù)后8周非機(jī)械通氣TAC組LVIDd 3.89±0.04 mm、LVEF45.07±4.19%與自身術(shù)前LVIDd 3.69±0.05 mm、LVEF 62.35±2.20%及假手術(shù)組術(shù)后LVIDd 3.71±0.04 mm、LVEF 61.93±2.28%比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。術(shù)后8周非機(jī)械通氣TAC組LW/BW 8.15±0.58較假手術(shù)組的5.23±0.22升高55.8%。結(jié)論:1、無(wú)呼吸機(jī)支持下微創(chuàng)手術(shù)建立小鼠TAC模型可減少操作時(shí)間,提高小鼠生存率;2、術(shù)后8周,無(wú)呼吸機(jī)支持下微創(chuàng)手術(shù)可成功建立TAC心力衰竭模型。第二部分心力衰竭小鼠心臟SERCA2a低表達(dá)的組蛋白乙�；瘷C(jī)制研究目的:第一部分成功建立微創(chuàng)TAC心力衰竭小鼠模型,為其發(fā)生機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase,SERCA)是心臟重要的功能蛋白,在心力衰竭心臟中SERCA2a蛋白及其m RNA表達(dá)量明顯降低,提示SERCA2a下降可能發(fā)生在其轉(zhuǎn)錄水平。組蛋白修飾可調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),研究發(fā)現(xiàn)組蛋白修飾可調(diào)控編碼SERCA2a的基因ATP2a2的表達(dá)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),心臟中HDAC1表達(dá)增加可降低組蛋白乙�；�。因此我們推測(cè)心力衰竭中心臟SERCA2a低表達(dá)可能與HDAC1介導(dǎo)的組蛋白低乙�；嘘P(guān)。本部分研究以組蛋白乙�；癁榍腥朦c(diǎn),探討心力衰竭小鼠心臟SERCA2a低表達(dá)的組蛋白乙�；碛^遺傳學(xué)機(jī)制。方法:第一部分術(shù)后8周獲取的小鼠心臟組織做如下檢測(cè):1、利用Q-PCR檢測(cè)SERCA2a m RNA和HDAC1 m RNA的表達(dá)水平;2、利用ChIP-Q-PCR檢測(cè)Atp2a2啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白H3、H3K4和H3K9乙�；�,HDAC1、GATA4和Mef2c的結(jié)合水平。結(jié)果:1、TAC組小鼠心肌SERCA2a m RNA表達(dá)水平顯著低于假手術(shù)組(p0.05),HDAC1 m RNA表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組(p0.05);2、TAC組小鼠心臟Atp2a2啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白H3、H3K9乙�；捷^假手術(shù)組低(p0.05),HDAC1的結(jié)合水平較假手術(shù)組增高(p0.05),Mef2c和GATA4結(jié)合水平較假手術(shù)組降低(p0.05)。結(jié)論:心力衰竭小鼠心臟Atp2a2啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白H3K9乙�；浇档涂赡芘cHDAC1 m RNA表達(dá)增高有關(guān),由此可引起轉(zhuǎn)錄因子GATA4及Mef2c與Atp2a2啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合減少,導(dǎo)致SERCA2a低表達(dá),提示Atp2a2啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白H3K9乙�；赡軈⑴cSERCA2a表達(dá)調(diào)控。第三部分EGCG抑制HDAC1上調(diào)SERCA2a表達(dá)防治TAC小鼠心力衰竭目的:第二部分研究發(fā)現(xiàn)心力衰竭小鼠心臟SERCA2a表達(dá)顯著降低,而HDAC1表達(dá)增高,引起Atp2a2啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3K9乙酰化水平降低,可能在其中發(fā)揮重要調(diào)控作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)EGCG可抑制HDAC1活性而上調(diào)組蛋白H3K9的乙�；�,因此EGCG選為本部分實(shí)驗(yàn)的干預(yù)劑,研究EGCG干預(yù)對(duì)TAC小鼠心臟SERCA2a低表達(dá)及心臟功能的影響,并探討其可能作用機(jī)制。方法:以3月齡c57小鼠為研究對(duì)象,將其隨機(jī)分為假手術(shù)組(SHAM組)、非機(jī)械通氣TAC組(TAC組)、TAC+EGCG組和SHAM+EGCG,TAC+EGCG組和SHAM+EGCG組術(shù)后第一天開(kāi)始連續(xù)給予腹腔注射EGCG 50mg/kg/d干預(yù)12周,SHAM組和TAC組注射生理鹽水對(duì)照,然后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn):1、采用超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)小鼠心臟功能;2、Western blot及Q-PCR檢測(cè)各組小鼠心肌SERCA2a蛋白及m RNA表達(dá)水平;3、檢測(cè)各組小鼠心肌中HDAC1的活性;4、ChIP-Q-PCR檢測(cè)ATP2a2啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白H3、H3K4、H3K9乙�；�,HDAC1結(jié)合水平,轉(zhuǎn)錄因子GATA4、Mef2c結(jié)合水平。結(jié)果:1、術(shù)后12周TAC+EGCG組小鼠心臟LVIDd 3.80±0.13 mm、LVEF62.24±3.07%較術(shù)前LVIDd 3.73±0.09 mm、LVEF 63.01±1.79%無(wú)明顯變化(p0.05);TAC組LVIDd 4.04±0.05 mm較術(shù)前3.73±0.09mm增大(p0.05),LVEF 41.37±7.79%較其術(shù)前62.99±1.81%降低(p0.05)。術(shù)后12周TAC+EGCG組LW/BW 5.29±0.09較假手術(shù)組的5.16±0.10差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);TAC組LW/BW 8.51±0.25較假手術(shù)組升高64.9%;2、TAC+EGCG組SERCA2a蛋白和m RNA水平較TAC組表達(dá)水平增高(p0.05),與SHAM組比較無(wú)明顯變化(p0.05);3、TAC+EGCG組Atp2a2啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3、H3K9乙�；脚cTAC組相比增高(p0.05),GATA4和Mef2c結(jié)合水平與TAC組比較有增高(p0.05),與假手術(shù)組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);4、TAC+EGCG組HDAC1活性以及與Atp2a2啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合水平較TAC組降低(p0.05),與SHAM組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。結(jié)論:1、EGCG干預(yù)可以防治TAC小鼠心力衰竭的發(fā)生;2、EGCG干預(yù)可能通過(guò)抑制TAC小鼠心臟中HDAC1活性,降低其與Atp2a2啟動(dòng)子結(jié)合水平,引起SERCA2a啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白H3K9乙�；缴�,促進(jìn)對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子GATA4和Mef2c與之結(jié)合,防止SERCA2a低表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R541.6
【圖文】：

8 小鼠手術(shù)前后主動(dòng)脈弓直徑比較，*p<0.05，假手術(shù)組 n=8; 機(jī)械通氣 TAC 手術(shù)組 n非機(jī)械通氣 TAC 手術(shù)組 n=28。gure 8 Comparison of aortic arch diameter before and after surgery in mice, *p<0.05, nam operation group; n=22 in TAC with mechanical ventilation group; n=28 in TAC witmechanical ventilation group..4 小鼠主動(dòng)脈弓血流速度及壓差假手術(shù)組小鼠、機(jī)械通氣 TAC 組和非機(jī)械通氣 TAC 組小鼠術(shù)前主動(dòng)脈速度及壓差差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)；術(shù)后假手術(shù)組小鼠主動(dòng)脈弓血流速差和術(shù)前比差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)；術(shù)后機(jī)械通氣TAC組和非機(jī)械通氣小鼠主動(dòng)脈弓血流速度及壓差兩組之間比較差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)，和前比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。（見(jiàn)表 1、圖 9）

圖 9 小鼠手術(shù)前后主動(dòng)脈弓血流速度及壓差比較，*p<0.05，假手術(shù)組 n=8; 機(jī)械通氣 TAC手術(shù)組 n=22; 非機(jī)械通氣 TAC 手術(shù)組 n=28。Figure 9 Comparison of aortic arch blood flow velocity and pressure gradient before and aftersurgery in mice, *p<0.05, n=8 in sham operation group; n=22 in TAC with mechanicalventilation group; n=28 in TAC without mechanical ventilation group.2.1.5 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)小鼠心臟功能利用超聲心動(dòng)圖檢測(cè)各組小鼠心臟功能。如表 2 所示，手術(shù)前機(jī)械通氣 TAC組、非機(jī)械通氣 TAC 組與假手術(shù)組三組小鼠心臟 LVAWd，LVPWd，LVIDd 和LVEF差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。手術(shù)后，機(jī)械通氣TAC組和非機(jī)械通氣TAC組LVAWd，LVPWd，LVIDd 和 LVEF 組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩組分別與自身術(shù)前及假手術(shù)組術(shù)后比較上述參數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。

圖 12 小鼠手術(shù)前后主動(dòng)脈弓直徑比較，*p<0.05， n=8。rison of aortic arch diameter before and after surgery in mice,表 4 手術(shù)前后小鼠主動(dòng)脈弓超聲參數(shù)比較ltrasound evaluation of aortic arch before and 3 days after opeSHAM (n=8) TAC (n=beforeoperation3 days afteroperationbeforeoperation1.51±0.10 1.56±0.03 1.47±0.04 820.93±41.98 925.94±102.00 910.38±56.56 282.70±0.28 3.47±0.77 3.32±0.40 sented as the mean ± SD. *, p<0.05 compared with before and operation in the each group by paired t test準(zhǔn)差表示。*表示各組術(shù)前和術(shù)后 3 天采用配對(duì) t 檢驗(yàn)進(jìn)行比弓血流速度和壓差

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本文編號(hào)：2750163