發(fā)布時間：2020-07-11 08:16

【摘要】：第一部分無呼吸機支持下微創(chuàng)小鼠主動脈弓縮窄心力衰竭模型的建立目的:主動脈弓縮窄(transverse aortic constriction,TAC)心力衰竭模型由于具有構建時間短、可重復性好等優(yōu)點,廣泛應用于壓力超負荷所致心力衰竭的研究。以往多在氣管插管機械通氣下建立這一動物模型,但小鼠氣管插管耗費時間較長,反復嘗試容易造成氣道損傷;且經(jīng)典TAC手術創(chuàng)傷較大,小鼠死亡率較高。為了減少氣道損傷和手術創(chuàng)傷導致的小鼠死亡,本研究擬采用不需氣管插管,經(jīng)面罩吸入麻醉及微創(chuàng)手術方式建立TAC模型,以降低模型構建過程中的小鼠死亡率。方法:1、3月齡c57小鼠為研究對象,分為假手術組、機械通氣TAC組和非機械通氣TAC組建立小鼠TAC模型。機械通氣TAC組在氣管插管機械通氣下,采用經(jīng)典TAC手術方式;非機械通氣TAC組保留自主呼吸,采用微創(chuàng)TAC手術方式;假手術組同非機械通氣TAC組,不同點在于手術過程中不對主動脈弓進行環(huán)縮;2、假手術組、機械通氣TAC組和非機械通氣TAC組小鼠術前及術后3天,利用高頻超聲檢測主動脈弓直徑、血流速度和壓差;術前及術后4周,利用超聲心動圖心動圖檢測LVAWd、LVIDd及LVPWd并計算LVEF值;術后4周取小鼠左心室心肌組織,HE染色后使用顯微鏡對心肌超微結構進行觀察;3、假手術組和非機械通氣TAC組術前及術后8周利用超聲心動圖檢測LVAWd、LVIDd及LVPWd并計算LVEF值,術后8周測量LW和BW,計算LW/BW值。結果:1、非機械通氣TAC組操作時間為10.86±2.36分鐘較機械通氣TAC組24.44±3.55分鐘明顯減少(p0.05);小鼠存活率增加,兩組分別為93.3%和73.3%(p0.05);2、假手術組、機械通氣TAC組和非機械通氣TAC組術前主動脈弓直徑、血流速度和壓差、LVAWd、LVIDd、LVPWd、和LVEF組間比較差異無統(tǒng)計學意義;術后3天或4周,機械通氣TAC組和非機械通氣TAC組上述指標比較差異無統(tǒng)計學意義(p0.05),而與自身術前及假手術組術后比較差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);比較假手術組,機械通氣TAC組和非機械通氣TAC組心肌細胞增大(p0.05);3、術后8周非機械通氣TAC組LVIDd 3.89±0.04 mm、LVEF45.07±4.19%與自身術前LVIDd 3.69±0.05 mm、LVEF 62.35±2.20%及假手術組術后LVIDd 3.71±0.04 mm、LVEF 61.93±2.28%比較差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。術后8周非機械通氣TAC組LW/BW 8.15±0.58較假手術組的5.23±0.22升高55.8%。結論:1、無呼吸機支持下微創(chuàng)手術建立小鼠TAC模型可減少操作時間,提高小鼠生存率;2、術后8周,無呼吸機支持下微創(chuàng)手術可成功建立TAC心力衰竭模型。第二部分心力衰竭小鼠心臟SERCA2a低表達的組蛋白乙�；瘷C制研究目的:第一部分成功建立微創(chuàng)TAC心力衰竭小鼠模型,為其發(fā)生機制的研究奠定了基礎。肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase,SERCA)是心臟重要的功能蛋白,在心力衰竭心臟中SERCA2a蛋白及其m RNA表達量明顯降低,提示SERCA2a下降可能發(fā)生在其轉錄水平。組蛋白修飾可調控基因的轉錄和表達,研究發(fā)現(xiàn)組蛋白修飾可調控編碼SERCA2a的基因ATP2a2的表達。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),心臟中HDAC1表達增加可降低組蛋白乙�；健Ｒ虼宋覀兺茰y心力衰竭中心臟SERCA2a低表達可能與HDAC1介導的組蛋白低乙�；嘘P。本部分研究以組蛋白乙�；癁榍腥朦c,探討心力衰竭小鼠心臟SERCA2a低表達的組蛋白乙�；碛^遺傳學機制。方法:第一部分術后8周獲取的小鼠心臟組織做如下檢測:1、利用Q-PCR檢測SERCA2a m RNA和HDAC1 m RNA的表達水平;2、利用ChIP-Q-PCR檢測Atp2a2啟動子區(qū)域組蛋白H3、H3K4和H3K9乙�；�,HDAC1、GATA4和Mef2c的結合水平。結果:1、TAC組小鼠心肌SERCA2a m RNA表達水平顯著低于假手術組(p0.05),HDAC1 m RNA表達水平顯著高于假手術組(p0.05);2、TAC組小鼠心臟Atp2a2啟動子區(qū)域組蛋白H3、H3K9乙�；捷^假手術組低(p0.05),HDAC1的結合水平較假手術組增高(p0.05),Mef2c和GATA4結合水平較假手術組降低(p0.05)。結論:心力衰竭小鼠心臟Atp2a2啟動子區(qū)域組蛋白H3K9乙�；浇档涂赡芘cHDAC1 m RNA表達增高有關,由此可引起轉錄因子GATA4及Mef2c與Atp2a2啟動子區(qū)的結合減少,導致SERCA2a低表達,提示Atp2a2啟動子區(qū)域組蛋白H3K9乙�；赡軈⑴cSERCA2a表達調控。第三部分EGCG抑制HDAC1上調SERCA2a表達防治TAC小鼠心力衰竭目的:第二部分研究發(fā)現(xiàn)心力衰竭小鼠心臟SERCA2a表達顯著降低,而HDAC1表達增高,引起Atp2a2啟動子區(qū)組蛋白H3K9乙�；浇档�,可能在其中發(fā)揮重要調控作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)EGCG可抑制HDAC1活性而上調組蛋白H3K9的乙�；�,因此EGCG選為本部分實驗的干預劑,研究EGCG干預對TAC小鼠心臟SERCA2a低表達及心臟功能的影響,并探討其可能作用機制。方法:以3月齡c57小鼠為研究對象,將其隨機分為假手術組(SHAM組)、非機械通氣TAC組(TAC組)、TAC+EGCG組和SHAM+EGCG,TAC+EGCG組和SHAM+EGCG組術后第一天開始連續(xù)給予腹腔注射EGCG 50mg/kg/d干預12周,SHAM組和TAC組注射生理鹽水對照,然后進行后續(xù)實驗:1、采用超聲心動圖評價小鼠心臟功能;2、Western blot及Q-PCR檢測各組小鼠心肌SERCA2a蛋白及m RNA表達水平;3、檢測各組小鼠心肌中HDAC1的活性;4、ChIP-Q-PCR檢測ATP2a2啟動子區(qū)域組蛋白H3、H3K4、H3K9乙�；�,HDAC1結合水平,轉錄因子GATA4、Mef2c結合水平。結果:1、術后12周TAC+EGCG組小鼠心臟LVIDd 3.80±0.13 mm、LVEF62.24±3.07%較術前LVIDd 3.73±0.09 mm、LVEF 63.01±1.79%無明顯變化(p0.05);TAC組LVIDd 4.04±0.05 mm較術前3.73±0.09mm增大(p0.05),LVEF 41.37±7.79%較其術前62.99±1.81%降低(p0.05)。術后12周TAC+EGCG組LW/BW 5.29±0.09較假手術組的5.16±0.10差異無統(tǒng)計學意義(p0.05);TAC組LW/BW 8.51±0.25較假手術組升高64.9%;2、TAC+EGCG組SERCA2a蛋白和m RNA水平較TAC組表達水平增高(p0.05),與SHAM組比較無明顯變化(p0.05);3、TAC+EGCG組Atp2a2啟動子區(qū)組蛋白H3、H3K9乙�；脚cTAC組相比增高(p0.05),GATA4和Mef2c結合水平與TAC組比較有增高(p0.05),與假手術組比較無統(tǒng)計學差異(p0.05);4、TAC+EGCG組HDAC1活性以及與Atp2a2啟動子區(qū)結合水平較TAC組降低(p0.05),與SHAM組比較無統(tǒng)計學差異(p0.05)。結論:1、EGCG干預可以防治TAC小鼠心力衰竭的發(fā)生;2、EGCG干預可能通過抑制TAC小鼠心臟中HDAC1活性,降低其與Atp2a2啟動子結合水平,引起SERCA2a啟動子區(qū)域組蛋白H3K9乙�；缴�,促進對應轉錄因子GATA4和Mef2c與之結合,防止SERCA2a低表達。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R541.6
【圖文】：

8 小鼠手術前后主動脈弓直徑比較，*p<0.05，假手術組 n=8; 機械通氣 TAC 手術組 n非機械通氣 TAC 手術組 n=28。gure 8 Comparison of aortic arch diameter before and after surgery in mice, *p<0.05, nam operation group; n=22 in TAC with mechanical ventilation group; n=28 in TAC witmechanical ventilation group..4 小鼠主動脈弓血流速度及壓差假手術組小鼠、機械通氣 TAC 組和非機械通氣 TAC 組小鼠術前主動脈速度及壓差差別無統(tǒng)計學意義(p>0.05)；術后假手術組小鼠主動脈弓血流速差和術前比差別無統(tǒng)計學意義(p>0.05)；術后機械通氣TAC組和非機械通氣小鼠主動脈弓血流速度及壓差兩組之間比較差別無統(tǒng)計學意義(p>0.05)，和前比差別有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。（見表 1、圖 9）

圖 9 小鼠手術前后主動脈弓血流速度及壓差比較，*p<0.05，假手術組 n=8; 機械通氣 TAC手術組 n=22; 非機械通氣 TAC 手術組 n=28。Figure 9 Comparison of aortic arch blood flow velocity and pressure gradient before and aftersurgery in mice, *p<0.05, n=8 in sham operation group; n=22 in TAC with mechanicalventilation group; n=28 in TAC without mechanical ventilation group.2.1.5 超聲心動圖檢測小鼠心臟功能利用超聲心動圖檢測各組小鼠心臟功能。如表 2 所示，手術前機械通氣 TAC組、非機械通氣 TAC 組與假手術組三組小鼠心臟 LVAWd，LVPWd，LVIDd 和LVEF差異無統(tǒng)計學意義。手術后，機械通氣TAC組和非機械通氣TAC組LVAWd，LVPWd，LVIDd 和 LVEF 組間比較差異無統(tǒng)計學意義，兩組分別與自身術前及假手術組術后比較上述參數(shù)差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。

圖 12 小鼠手術前后主動脈弓直徑比較，*p<0.05， n=8。rison of aortic arch diameter before and after surgery in mice,表 4 手術前后小鼠主動脈弓超聲參數(shù)比較ltrasound evaluation of aortic arch before and 3 days after opeSHAM (n=8) TAC (n=beforeoperation3 days afteroperationbeforeoperation1.51±0.10 1.56±0.03 1.47±0.04 820.93±41.98 925.94±102.00 910.38±56.56 282.70±0.28 3.47±0.77 3.32±0.40 sented as the mean ± SD. *, p<0.05 compared with before and operation in the each group by paired t test準差表示。*表示各組術前和術后 3 天采用配對 t 檢驗進行比弓血流速度和壓差

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本文編號：2750163