【摘要】：多種心血管疾病可導致心肌肥大,處于失代償階段的肥大心肌細胞,除了收縮舒張功能下降之外,也會出現(xiàn)電生理活動的紊亂,由此誘發(fā)心律失常的發(fā)作。開發(fā)既能夠抗心肌肥大,又能夠抗心律失常的藥物,顯得尤為重要。葛根素(Puerarin)具有多種藥理活性,既往研究證實葛根素可以抑制心肌肥大,但對于葛根素的抗心律失常作用,特別是針對人源肥大心肌細胞的抗心律失常作用,則未見報道。目的:探討葛根素對人源肥大心肌細胞電生理活動的影響。方法:從健康人體排出的尿液中提取上皮樣細胞,然后將攜帶Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc基因的仙臺病毒轉(zhuǎn)染上皮樣細胞,經(jīng)重編程得到人源誘導多能干細胞(Human Induced pluripotent stem cells,hIPSCs),并檢測其多能性。將誘導多能干細胞單層培養(yǎng),并在細胞生長不同階段加入WNT信號通路激活及抑制劑的時序性調(diào)控方法,將人源誘導多能干細胞定向分化為心肌細胞。然后模擬心肌肥大患者體內(nèi)局部ET-1濃度的明顯升高,通過培養(yǎng)基中加入ET-1來誘導心肌細胞肥大,制作肥大心肌細胞模型。利用實時無標記細胞分析儀進行葛根素對心肌細胞的安全性檢測。最后運用全細胞膜片鉗技術,測定葛根素對肥大心肌細胞電生理活動的影響。結(jié)果:成功地從人體排出的尿液中提取上皮樣細胞,對獲得的hIPSCs進行堿性磷酸酶及多能標志物的免疫熒光染色,同時也進行了畸胎瘤形成試驗,證實獲得的hIPSCs具有多能性,并對獲得的hIPSCs進行了染色體核型分析,結(jié)果顯示其染色體核型正常。hIPSCs定向分化為心肌細胞,可表達肌鈣蛋白(TNNT2)和a-肌動蛋白(a-actinin)以及心肌特異基因NKX2-5、MYL2、MYH6和MYH7。用ET-1誘導人源心肌細胞,觀察到心肌細胞出現(xiàn)肥大反應,檢測到BNP、α-actinin明顯升高,MYH7/MYH6比值增大。實時無標記細胞分析儀結(jié)果提示,系列濃度葛根素對心肌細胞的cell index、beating rate、amplitude影響不大。肥大心肌細胞組以及葛根素后處理組輕微延長hiPSC-CMs APD90,明顯延長了APD50和APD30,延長了心肌細胞動作電位整體時程。心肌細胞動作電位0期除極幅度(APA)沒有顯著性差異,對0期最大除極速度(Vmax)有明顯減小的作用。與對照組相比,肥大心肌細胞組鈉通道峰值電流密度顯著降低。葛根素組及葛根素后處理組不能改善肥大心肌細胞鈉通道的電流。但是,葛根素預處理可以改善肥大心肌細胞鈉電流。各組激活曲線、失活曲線V50及Slope和恢復曲線Tau之間的比較無明顯統(tǒng)計學差異。結(jié)論:獲得的誘導多能干細胞可定向分化為心肌細胞,其電生理學高度近似于成人心室肌細胞;葛根素對肥大心肌細胞動作電位的0期最大除極速度有改善作用,其機制可能是通過增加INa峰值密度。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R54
【圖文】：

邐博士學位論文貼壁現(xiàn)象，見圖１－１Ｂ。繼續(xù)培養(yǎng)，可觀察到上皮樣細胞開始增殖，見圖１－１Ｃ。逡逑繼續(xù)培養(yǎng)至第７天及第１０天，可觀察到上皮樣細胞增殖更為明顯，見圖１－１及圖１－１Ｅ。培養(yǎng)至第１０天觀察細胞團足以傳代，使用０．２５％胰酶消化進行傳代細胞傳代后繼續(xù)培養(yǎng)，直至Ｐ２代（圖１－１Ｆ），可開始啟動重編程，并凍存部保種。逡逑

２．２上皮樣細胞重編程逡逑轉(zhuǎn)染當天，可觀察到上皮樣細胞生長狀態(tài)良好，細胞完全貼壁和伸展，見逡逑圖１－２Ａ。轉(zhuǎn)染后１２天可以觀察到克隆的形成，見圖１－２Ｂ；轉(zhuǎn)染后２８天，克隆逡逑生長到合適的大小用于轉(zhuǎn)移，見圖１－２Ｃ；挑取克隆，將其轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿上用于逡逑進一步的擴增和分析，見圖１－２Ｄ。逡逑圖１－２上皮樣細胞重編程圖片逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ－２邋Ｉｍａｇｅｓ邋ｏｆ邋ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ邋ｏｆ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉｏｉｄ邋ｃｅｌｌｓ逡逑２．３邋ＩＰＳＣｓ免疫熒光染色逡逑用免疫熒光染色法檢測上皮樣細胞重編程所獲得的ＩＰＳＣｓ的多能標記物，逡逑包括邋ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＳＳＥＡ－４邋的表達情況，可檢逡逑測到這些多能標記物在活動的ＩＰＳＣｓ細胞中均可表達，見圖１－３。逡逑１８逡逑

第一部分獲得人源誘導多能干細胞ｉｇｕｒｅ邋１－３邋Ｉｍａｇｅｓ邋ｏｆ邋ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ邋ｍａｒｋｅｒｓ邋ｉｎ邋ＩＰＳＣｓ邋（Ａ＞邋Ｄ＞逡逑、Ｍ、Ｐ邋ａｒｅ邋ＤＡＰＩ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ；邋Ｂ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ邋ａｒｅ邋ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ＴＲＡ－１－ＴＲＡ－１－８１、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＳＳＥＡ－４；Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｏ、Ｒａｒｅ邋ｍｅｒｇｅｒ）逡逑．４邐ＩＰＳＣｓ核型分析結(jié)果逡逑ＩＰＳＣｓ進行核型分析，結(jié)果顯示，染色體４６條，核型正常，見圖１

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8 王s

本文編號：2747426