發(fā)布時間：2020-07-09 09:40

【摘要】：背景:肺高壓(pulmonary hypertension,PH)是一種臨床常見的病理過程,也是臨床多種心肺疾病常見的并發(fā)癥,低氧性肺高壓(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)是其中一種重要的類型。HPH的基本特征是肺動脈血管的收縮和重構(gòu),導(dǎo)致右心衰竭和死亡~([1-3]),但是其發(fā)病機制尚不清楚。以往研究證明肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cell,PASMC)的增殖是肺血管重構(gòu)發(fā)生的關(guān)鍵因素~([4-6])。因此,抑制低氧時PASMC的增殖和血管的重構(gòu)是防治HPH的重要措施之一。κ-阿片受體(κ-opioid receptor,κ-OR)在心血管系統(tǒng)中廣泛存在~([7])。我們課題組前期發(fā)現(xiàn),κ-OR選擇性激動劑U50,488H能夠通過興奮κ-OR發(fā)揮抗心肌缺血再灌注損傷的作用。此外還發(fā)現(xiàn),κ-OR在肺動脈上也有表達并且在低氧時其表達明顯增高~([8])。進一步實驗表明U50,488H可興奮κ-OR發(fā)揮抗HPH的作用,但是其具體作用機制尚不清楚。自噬是一種細胞適應(yīng)性的降解過程,在生理與病理狀態(tài)下都發(fā)揮著重要的作用。自噬一方面可以清除細胞內(nèi)的毒性物質(zhì)、病原體以及受損的細胞器等,從而維持細胞的正常代謝平衡和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài);另一方面外界刺激可能會引發(fā)過度的自噬,破壞了細胞環(huán)境的穩(wěn)態(tài),進而引發(fā)某些疾病。近年來的研究發(fā)現(xiàn)PH病人和HPH小鼠的肺組織中自噬的標(biāo)志性蛋白LC3B的表達均升高,說明可能自噬與HPH的發(fā)生關(guān)系緊密,隨后有研究證實使用自噬抑制劑氯喹可能具有抗HPH的作用。那么κ-OR興奮后抗HPH的作用機制是否與自噬有關(guān)呢?我們進一步檢索文獻表明,μ-OR的興奮能夠抑制脂多糖誘導(dǎo)的骨髓巨噬細胞的自噬~([9]),但是κ-OR的興奮是否對PASMC的自噬有調(diào)節(jié)作用仍不清楚。為此,我們利用HPH的整體和細胞模型,觀察了PASMC自噬在κ-OR興奮抗HPH中的作用及機制。目的:(1)探究κ-OR興奮在抗HPH中的作用;(2)探究自噬在HPH中的作用;(3)探究自噬在κ-OR興奮抗HPH中的作用及機制。方法:(1)將雄性SD大鼠置于低壓低氧箱(大氣壓50 kPa,氧濃度約10%)中,每天低氧的時間為8 h,連續(xù)3周。低氧處理結(jié)束后,進行血流動力學(xué)檢測,研究κ-OR選擇性激動劑U50,488H、κ-OR選擇性阻斷劑nor-BNI以及自噬抑制劑氯喹對HPH大鼠的平均肺動脈壓力(mean pulmonary arterial pressure,mPAP)和右心室壓力(right ventricle pressure,RVP)的影響。(2)用HE染色檢測U50,488H、nor-BNI以及氯喹對于HPH大鼠肺血管重構(gòu)的影響。(3)對PASMC進行原代和傳代培養(yǎng),置于低氧培養(yǎng)箱(93%N_2,5%CO_2,2%O_2,37℃)中24 h建立HPH細胞模型。(4)用CCK8試劑盒檢測U50,488H、nor-BNI以及氯喹對低氧時PASMC增殖的影響。(5)用流式細胞術(shù)檢測U50,488H、nor-BNI和氯喹對低氧時PASMC凋亡的影響。(6)用Western blotting檢測組織和細胞中的β-actin、LC3B、p62、Beclin-1、caspase3、p-mTOR、mTOR、p-AMPK、AMPK蛋白分子表達。(7)用mRFP-GFP-LC3熒光雙標(biāo)腺病毒轉(zhuǎn)染PASMC檢測細胞自噬過程的變化。結(jié)果:一、κ-OR興奮在抗HPH中的作用(1)慢性低氧3周后,大鼠的mPAP和RVP都有顯著的提高,肺血管的厚度增加,管腔減小;在細胞水平,低氧24 h可誘導(dǎo)PASMC顯著增殖,表明成功建立了動物以及細胞的HPH模型。(2)k-OR選擇性激動劑U50,488H能夠通過興奮k-OR逆轉(zhuǎn)慢性低氧引起的mPAP和RVP的增加,抑制低氧引起的肺小動脈的結(jié)構(gòu)重構(gòu),k-OR選擇性阻斷劑nor-BNI能夠阻斷以上U50,488H的作用。(3)在細胞水平,U50,488H可以劑量依賴性地抑制低氧誘導(dǎo)的PASMC的增殖并促進其凋亡,這種作用可以被nor-BNI所阻斷。二、自噬在HPH中的作用(1)低氧能夠誘導(dǎo)HPH的形成,低氧前給予自噬抑制劑氯喹能夠降低HPH大鼠的mPAP和RVP,抑制HPH大鼠肺血管的重構(gòu)。(2)在細胞水平,低氧前給予自噬抑制劑氯喹,不僅可以抑制低氧誘導(dǎo)的PASMC的增殖,還能夠促進它的凋亡。三、自噬在κ-OR興奮抗HPH中的作用及機制(1)低氧3周后,檢測肺動脈自噬分子LC3B、Beclin-1和p62的表達,發(fā)現(xiàn)與正常組即常氧組相比,HPH大鼠肺動脈的LC3B-II/-I的比值與Beclin-1的表達明顯增高而p62的表達降低,說明低氧誘導(dǎo)自噬水平增高。(2)與低氧組相比,低氧前預(yù)先給予U50,488H可顯著降低肺動脈LC3B-II/-I的比值和Beclin-1的表達,同時增加p62的表達,表明U50,488H能夠抑制HPH大鼠的自噬。(3)在細胞水平,低氧時PASMC自噬水平升高。Western blotting以及mRFP-GFP-LC3熒光結(jié)果提示,低氧前預(yù)先給予U50,488H能夠濃度依賴性的抑制低氧時PASMC的自噬,這種作用可以被nor-BNI所阻斷。(4)低氧時U50,488H可以通過抑制自噬來達到抗PASMC增殖和誘導(dǎo)PASMC凋亡的作用。(5)低氧可提高PASMC的AMPK的磷酸化和mTOR的去磷酸化,而U50,488H則能夠逆轉(zhuǎn)低氧誘導(dǎo)的這種變化,U50,488H這種作用可被nor-BNI所阻斷。(6)AMPK選擇性激動劑AICAR和mTOR選擇性阻斷劑rapamycin都能夠減弱低氧時U50,488H對PASMC自噬的抑制作用。結(jié)論:(1)κ-OR興奮具有抗HPH的作用。(2)低氧可促進PASMC自噬,而后者可導(dǎo)致PASMC的增殖和降低PASMC的凋亡,最終導(dǎo)致HPH的發(fā)生。(3)κ-OR興奮能夠通過抑制AMPK-mTOR信號通路進而抑制自噬,降低了低氧時PASMC的增殖并且促進了PASMC的凋亡,最終達到抑制肺血管的重構(gòu)和抗HPH的作用。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R544.1
【圖文】：

圖 1 低氧刺激下肺血管變化示意圖我國高原面積廣，海拔高，人口多，高原地區(qū)占我國國土面積的 26%，居住在2500m 海拔以上的人口有 6000~8000 萬，因而積極探究 HPH 的發(fā)病機制以及尋找有效的治療疾病的方法顯得尤為重要。2.2 HPH 的發(fā)病機制當(dāng)機體受到低氧的刺激后，就會通過促進紅細胞生成來提高動脈血氧的濃度。研究表明，除少部分種屬會出現(xiàn)抵抗外，在鼠和人類等多種種屬中都觀察到慢性低氧刺激會引起肺血管重構(gòu)。然而，紅細胞的生成量會因為低氧刺激導(dǎo)致的肺血管收縮和重構(gòu)進一步增多，引起右心室負荷增加，最終導(dǎo)致右心衰竭而死亡。HPH的主要病理基礎(chǔ)是遠端正常的非肌性動脈的肌化所導(dǎo)致的血管壁增厚以及肌性動脈肌化的增多。缺氧的直接作用點是內(nèi)皮細胞，低氧環(huán)境的刺激會導(dǎo)致內(nèi)皮細胞損傷，細胞肥大、增生并且功能出現(xiàn)異常，造成血小板活化和凝集、血栓調(diào)節(jié)素及纖維蛋白溶解系統(tǒng)異常，肺血管通透性增加[25]，肺動脈原位血栓形成；與此同

- 22 -圖 2 自噬的三種途徑示意圖自噬的發(fā)生過程大致分 4 個階段（如圖 3）：（1）自噬體膜新生與延伸：在饑餓及某些因素的影響下，降解物被雙層膜的杯狀分隔膜所包繞；（2）自噬體結(jié)構(gòu)成熟化：分隔膜不斷延伸，包繞被降解的胞漿成為自噬體；（3）自噬-溶酶體融合：自噬

- 23 -圖 3 自噬過程示意圖2.自噬的功能自噬過程在細胞正常生理和病理狀態(tài)下都有存在，但是發(fā)揮的作用卻不完全一致。正常狀態(tài)下細胞很少發(fā)生自噬，有刺激因素時細胞出現(xiàn)自噬，自噬可以清除細胞內(nèi)的毒物、病原體以及受損的細胞器來保持細胞重要的功能，維持細胞的生存；同時也可能會出現(xiàn)過度的自噬，破壞了細胞環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，進而引發(fā)某些疾病。2.1 自噬的生理功能（1）自噬與細胞代謝：自噬能夠通過清除缺陷蛋白以及降解受損和多余的細胞器參與細胞新陳代謝和維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。

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7 周q

本文編號：2747285