【摘要】：背景:高血壓是指動脈收縮壓高于130mm Hg和(或)舒張壓高于80mm Hg的綜合征,是誘發(fā)卒中、冠心病、慢性腎病、心衰等多種并發(fā)癥的重要危險因素,嚴重影響患者的生活質(zhì)量并給國民經(jīng)濟造成了沉重的負擔。高血壓血管重構(gòu)是引起上述并發(fā)癥的關(guān)鍵病理始動因素,表現(xiàn)為繼發(fā)于高血壓后的血管內(nèi)膜新生,中膜增厚,管腔狹窄,彈性降低。當高血壓血管重構(gòu)發(fā)生時,位于血管壁中層的平滑肌細胞出現(xiàn)表型轉(zhuǎn)換,即從收縮態(tài)細胞表型轉(zhuǎn)變?yōu)樵鲋尺w移能力更強的增殖分泌態(tài)表型,血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)換同時也是導(dǎo)致血管瘤、動脈粥樣硬化等血管疾病的核心病理基礎(chǔ),但其分子機制尚不明確。同時,高血壓也是導(dǎo)致心衰的重要危險因素,隨著心臟后負荷的增加,心肌細胞出現(xiàn)病理性肥大,失代償后心臟收縮舒張功能紊亂最終導(dǎo)致心衰,而目前對于病理性心肌肥大的發(fā)生和分子機制的認識十分有限。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)是近年來發(fā)現(xiàn)并得到廣泛關(guān)注的一類非編碼RNA。lnc RNA是指長度超過200nt的不編碼蛋白質(zhì)的RNA,種類繁多,功能多樣,能夠參與從轉(zhuǎn)錄到蛋白翻譯后修飾的眾多生物學過程中。lnc RNA在生物發(fā)育、疾病的發(fā)生中的必要作用逐漸得到揭示,在心血管系統(tǒng)中,lnc RNA在心臟發(fā)育、心肌再生、動脈粥樣硬化、心肌肥大和心肌梗死等生理病理過程中的作用已有報道,但lnc RNA在高血壓血管重構(gòu)中的作用尚不清楚,而更多的參與心肌肥大的lnc RNA也有待研究。為此本課題分為兩部分,通過lnc RNA表達譜芯片分別尋找到參與高血壓血管重構(gòu)和心臟后負荷增高誘導(dǎo)心肌肥大的lnc RNA,并深入研究其分子機制,探索其成為新的治療靶點的潛能。第一部分lnc PSR通過其非編碼轉(zhuǎn)錄本及編碼Arteridin蛋白的雙重作用促進血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)換方法:第一章:1.1使用lnc RNA-m RNA表達譜芯片檢測24周齡自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)和正常血壓對照大鼠(WKY)胸主動脈組織中差異性表達的lnc RNA,并使用q RT-PCR驗證差異表達的lnc RNA。使用RT-PCR檢測差異表達lnc RNA的組織表達特異性,重點關(guān)注血管組織特異性表達的lnc RNA Phenotype Switching Regulator(PSR)。使用lnc PSR RNA熒光原位雜交(FISH)分析lnc PSR在血管組織血管平滑肌細胞中的定位,并通過血管平滑肌細胞中FISH及核質(zhì)分離檢測lnc PSR亞細胞定位。1.2使用基因組生物信息學工具分析lnc PSR在大鼠、小鼠和人中的保守性,得到對應(yīng)的序列信息。收集臨床高血壓血管重構(gòu)腸系膜動脈標本,使用q RT-PCR驗證人lnc PSR表達水平。1.3在血管平滑肌A10細胞中敲降lnc PSR,使用q RT-PCR及蛋白質(zhì)免疫印跡(WB)檢測收縮態(tài)蛋白(α-SMA,α-MHC,Calponin)表達的變化;使用CCK8和Ki-67染色實驗檢測敲降lnc PSR后A10細胞增殖能力的改變;使用細胞劃痕實驗和細胞小室Trans-well實驗檢測敲降lnc PSR后A10細胞遷移能力的改變。1.4構(gòu)建lnc PSR全身敲除大鼠,使用頸動脈球囊損傷模型誘導(dǎo)在體血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)換,HE染色檢測血管內(nèi)膜新生水平,Ki-67染色檢測血管平滑肌細胞增殖水平。第二章:2.1使用生物信息學工具分析lnc PSR中潛在的開放閱讀框(ORF),并比較該ORF在大鼠、小鼠、人中的保守性,使用二級結(jié)構(gòu)預(yù)測工具分析其可能的二級結(jié)構(gòu)。2.2制作特異性抗體,在大鼠不同組織中檢測潛在的蛋白表達,根據(jù)組織特異性將該蛋白命名為Arteridin�；贏rteridin序列構(gòu)建帶有標簽蛋白的過表達載體,在HEK293細胞中驗證表達能力。使用免疫熒光檢測內(nèi)源性Arteridin和過表達Arteridin在細胞中的定位。2.3使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建Arteridin蛋白敲除大鼠,不影響lnc PSR轉(zhuǎn)錄本的表達,檢測球囊損傷模型后新生內(nèi)膜情況。將人Arteridin蛋白過表達于大鼠血管平滑肌細胞,檢測Arteridin蛋白功能的保守性。使用人Arterdindin抗體,免疫組化檢測高血壓血管重構(gòu)組織中Arteridin表達情況。2.4在大鼠血管平滑肌A10細胞中過表達lncPSR全長序列,qRT-PCR檢測對收縮態(tài)蛋白轉(zhuǎn)錄的影響。通過過表達不同突變載體,q RT-PCR檢測對收縮態(tài)蛋白轉(zhuǎn)錄的影響,明確lnc PSR的功能是來源于轉(zhuǎn)錄本還是Arteridin蛋白質(zhì)。在A10細胞中過表達lnc PSR全長序列ATT突變質(zhì)粒、Arteridin過表達質(zhì)粒和si-lnc PSR,使用RNA-seq檢測對血管平滑肌細胞轉(zhuǎn)錄組的影響,證實lnc PSR轉(zhuǎn)錄本及Arteridin蛋白質(zhì)均能促進血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)換。第三章:3.1使用Arteridin免疫共沉淀(co-IP)結(jié)合蛋白質(zhì)譜(LC-MS),在血管平滑肌細胞中尋找到Arteridin的結(jié)合蛋白YBX1,使用co-IP驗證結(jié)合。依據(jù)YBX1功能結(jié)構(gòu)域,構(gòu)建YBX1功能結(jié)構(gòu)域刪除的過表達載體,使用co-IP明確YBX1具體哪個結(jié)構(gòu)域負責與Arteridin結(jié)合。3.2使用腺病毒在大鼠血管平滑肌A7r5細胞中過表達Arteridin-FLAG和YBX1-HA,使用免疫熒光檢測二者共定位,及Arteridin-FLAG過表達前后YBX1-HA細胞質(zhì)細胞核分布的改變。使用WB檢測Arteridin-FLAG過表達前后YBX1-HA細胞質(zhì)細胞核分布的改變。3.3在A7r5細胞中分別使用si RNA敲降YBX1和用腺病毒過表達YBX1,使用q RT-PCR檢測血管平滑肌細胞收縮態(tài)蛋白基因的表達;使用TGF-β刺激A7r5細胞后,使用q RT-PCR檢測YBX1和lnc PSR m RNA水平的改變,看二者是否受同一信號通路調(diào)控;最后在A7r5細胞中過表達Arteridin-FLAG,同時敲降YBX1,明確Arteridin發(fā)揮功能是否依賴于YBX1。第四章:4.1在A10細胞、A10細胞過表達Arteridin-FLAG和大鼠胸主動脈組織中使用Arteridin抗體進行染色質(zhì)免疫共沉淀DNA測序(Ch IP-seq)檢測Arteridin結(jié)合的DNA。4.2使用雙熒光素酶報告基因檢測Arteridin對lnc PSR自身轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。并使用q RT-PCR檢測Arteridin-FLAG過表達后lnc PSR轉(zhuǎn)錄水平的改變。4.3使用RNA免疫共沉淀(RIP)檢測lnc PSR轉(zhuǎn)錄本能否與Arteridin蛋白和YBX1-HA蛋白結(jié)合,以及YBX1結(jié)合lnc PSR的功能結(jié)構(gòu)域。結(jié)果:第一章血管平滑肌細胞特異性lnc RNA PSR的發(fā)現(xiàn)鑒定及其在血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)換中的作用1.1 lnc RNA-m RNA表達譜芯片篩選出了在SHR和WKY大鼠胸主動脈中差異表達(p0.05,差異倍數(shù)1.2)的39條lnc RNA,通過q RT-PCR驗證差異表達lnc RNA。RT-PCR電泳檢測lnc RNA在不同組織表達,NR_027983(LOC680254基因)特異性表達于血管組織,作為候選我們將其命名為lnc RNA PSR。RNA FISH結(jié)合免疫熒光染色標記主動脈中層血管平滑肌細胞(α-SMA)和內(nèi)皮細胞(v WF)發(fā)現(xiàn)lnc PSR主要分布于血管平滑肌細胞。在大鼠血管平滑肌細胞中,FISH和核質(zhì)分離檢測,發(fā)現(xiàn)lnc PSR在細胞核細胞質(zhì)均有分布,更多表達于細胞質(zhì)。1.2使用UCSC和ENSEMBL分析lnc PSR的物種間保守性,發(fā)現(xiàn)lnc PSR在小鼠(NR_027984)和人(NR_027982)中均有表達。q RT-PCR檢測表明在高血壓患者發(fā)生血管重構(gòu)的腸系膜動脈中l(wèi)nc PSR表達的升高。1.3 lnc RNA表達在4周和14周SHR大鼠胸主動脈組織中不升高,在24周齡SHR大鼠出現(xiàn)升高,即高血壓穩(wěn)定存在之后,提示lnc PSR可能參與了高血壓血管重構(gòu)。血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)換在血管重構(gòu)中發(fā)揮重要作用,使用si RNA在大鼠胸中動脈A10細胞中敲降lnc PSR,q RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)收縮態(tài)蛋白基因表達表達顯著上升,WB檢測顯示蛋白水平也相應(yīng)升高,提示血管平滑肌細胞收縮態(tài)表型得以維持。使用CCK8實驗和Ki-67實驗檢測了lnc PSR敲降后,在基礎(chǔ)狀態(tài)下或PDGF-BB誘導(dǎo)細胞增殖條件下,A10細胞增殖水平降低。細胞劃痕實驗和細胞小室Trans-well實驗,檢測PDGF-BB誘導(dǎo)的細胞增殖,發(fā)現(xiàn)敲降lnc PSR后,A10細胞遷移能力減弱。1.4通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),我們構(gòu)建了lnc PSR基因敲除大鼠,發(fā)現(xiàn)lnc PSR基因敲除大鼠使用頸動脈球囊損傷誘導(dǎo)的內(nèi)膜新生顯著降低,Ki-67染色提示血管平滑肌細胞的增殖水平下降。第二章lnc PSR轉(zhuǎn)錄本和其編碼的Arteridin蛋白都能促進血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)換2.1在lnc PSR序列中發(fā)現(xiàn)了一段編碼117aa的ORF,該ORF在小鼠中同樣存在,在人中為一段106aa的ORF。2.2針對大鼠117aa ORF制作抗體,在大鼠不同組織中使用WB檢測內(nèi)源性表達,發(fā)現(xiàn)其在主動脈血管組織中特異性表達,分子量為12.9k Da,我們將這段蛋白命名為Arteridin。構(gòu)建Arterdin帶有FLAG或e GFP標簽的過表達載體,使用WB檢測在HEK293細胞中成功表達,而突變了ATG的載體沒有表達。在大鼠胸主動脈A7r5血管平滑肌細胞中,使用免疫熒光檢測Arteridin內(nèi)源性表達和過表達后的細胞分布,發(fā)現(xiàn)Arteridin主要表達在細胞核中。2.3使用CRISPR/Cas-9基因編輯工具,我們在大鼠Arteridin起始密碼子后插入T堿基形成提前的終止密碼子,從而抑制了Arteridin表達而不影響lnc PSR本身的轉(zhuǎn)錄。使用頸動脈球囊損傷誘導(dǎo)內(nèi)膜新生,與WT大鼠相比,Arteridin敲除大鼠中新生內(nèi)膜顯著降低。我們還將人的Arteridin過表達在大鼠A7r5細胞中,發(fā)現(xiàn)收縮態(tài)蛋白表達下降,提示Arteridin促進血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)換功能的保守性。使用針對人106aa的Arteridin抗體,免疫組化檢測了高血壓血管重構(gòu)患者腸系膜動脈組織中Arteridin表達升高并定位于新生內(nèi)膜中。2.4在A10細胞中過表達lnc PSR全長序列降低收縮態(tài)蛋白的表達,即促進了VSMCs表型轉(zhuǎn)換。為了進一步明確該作用是來源于lnc PSR轉(zhuǎn)錄本還是Arteridin蛋白,我們設(shè)計了lnc PSR全長序列ATT突變、Arteridin重組蛋白等載體,發(fā)現(xiàn)過表達后均能降低收縮態(tài)蛋白的表達,表明lnc PSR轉(zhuǎn)錄本和Arteridin蛋白均能促進了VSMCs表型轉(zhuǎn)換。最后我們使用RNA-seq在轉(zhuǎn)錄組層面證實了這一結(jié)論。第三章Arteridin蛋白通過結(jié)合YBX1促進血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)換3.1在Arteridin co-IP聯(lián)合LC-MS蛋白質(zhì)譜檢測發(fā)現(xiàn)在A10細胞中,與內(nèi)源性Arteridin和過表達的Arteridin結(jié)合信號最強的蛋白是YBX1,co-IP驗證了二者的結(jié)合。人Arteridin和YBX1的結(jié)合同樣存在,表明Arteridin與YBX1的結(jié)合具有保守性。構(gòu)建YBX1功能結(jié)構(gòu)域刪除的過表達載體:YBX1-Del N-HA,YBX1-Del CSD-HA,及YBX1-Del C-HA,co-IP表明YBX1的C端結(jié)構(gòu)域負責與Arteridin蛋白結(jié)合。3.2在A7r5細胞中使用腺病毒過表達了YBX1-HA,和Arteridin-FLAG,免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)在單獨過表達YBX1-HA時,YBX1主要分布在細胞質(zhì),而當同時過表達Arteridin-FLAG后,YBX1轉(zhuǎn)位到細胞核,與Arteridin共定位形成核內(nèi)的聚合體。WB檢測細胞核和細胞質(zhì)蛋白,驗證了當Arteridin過表達后,YBX1從細胞質(zhì)向細胞核的轉(zhuǎn)位。3.3在A7r5細胞中單獨使用si RNA敲降YBX1,使用腺病毒過表達YBX1,q RT-PCR檢測收縮態(tài)蛋白基因表達的改變。發(fā)現(xiàn)當敲降YBX1后,α-SMA和Calponin表達上升;當過表達YBX1后,α-SMA和Calponin表達下降,這一結(jié)果與干預(yù)Arteridin一致。在A7r5細胞中過表達Arteridin-FLAG,同時敲降YBX1,逆轉(zhuǎn)了Arteridin過表達對α-SMA和Calponin表達的抑制,表明Arteridin促進血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)換的作用是依賴于YBX1的。第四章Arteridin蛋白自身調(diào)控lnc PSR轉(zhuǎn)錄形成正反饋環(huán)路4.1在A10細胞中使用Arteridin抗體進行了染色質(zhì)免疫共沉淀DNA測序(Ch IP-seq),發(fā)現(xiàn)Arteridin能夠結(jié)合基因組DNA。而其中、Ch IP-seq中Arteridin能夠結(jié)合lnc PSR基因啟動子區(qū)域和第二外顯子引起了我們的關(guān)注。4.2使用了雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)構(gòu)建不同長度的lnc PSR啟動子區(qū)域和第二外顯子,發(fā)現(xiàn)Arteridin能夠通過調(diào)控lnc PSR啟動子223-666區(qū)段促進lnc PSR轉(zhuǎn)錄。在A10細胞中過表達Arteridin-FLAG和Arteridin過表達質(zhì)粒均能升高lnc PSR m RNA水平。4.3在A10細胞中分別過表達Arteridin-FLAG,YBX1-HA以及YBX1刪除功能結(jié)構(gòu)域的質(zhì)粒,使用RIP檢測這些蛋白能否與lnc PSR結(jié)合,發(fā)現(xiàn)Arteridin和YBX1均能與lnc PSR結(jié)合,YBX1的CSD結(jié)構(gòu)域及C端結(jié)構(gòu)域參與結(jié)合lnc PSR。結(jié)論1.1 lnc PSR是特異性表達于血管平滑肌細胞的具有物種間保守性的lnc RNA,在血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)換中必不可少;1.2 lnc PSR能夠編碼一段物種間保守的血管組織特異性表達的蛋白質(zhì)Arteridin,而lnc PSR通過其RNA轉(zhuǎn)錄本和Arteridin蛋白雙重作用促進血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)換;1.3 Arteridin結(jié)合YBX1,促進YBX1核轉(zhuǎn)位,Arteridin促進血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)換依賴于YBX1;1.4 Arteridin通過調(diào)控lnc PSR啟動子區(qū)域,促進lnc PSR轉(zhuǎn)錄,形成“自身調(diào)控”正反饋環(huán)路。同時lnc PSR能夠結(jié)合Arteridin及YBX1蛋白,是Arteridin-YBX1復(fù)合物的組成部分。第二部分lnc RNA Ahit通過結(jié)合SUZ12抑制MEF2A轉(zhuǎn)錄保護心肌肥大的相關(guān)研究方法:第一章:1.1使用lnc RNA-m RNA表達譜芯片檢測小鼠主動脈橫斷面縮窄術(shù)(TAC)模型誘導(dǎo)心肌肥大2周后心臟組織中差異性表達的lnc RNA,并使用q RT-PCR驗證差異表達的lnc RNA。依據(jù)組織表達特異性及差異表達倍數(shù)選出其中一個候選lnc RNA Ahit;使用生物信息學工具分析Ahit的物種間保守性和編碼潛能;1.2在NRCMs心肌細胞中敲降和過表達Ahit,同時使用PE誘導(dǎo)心肌肥大,檢測心肌細胞面積、心肌肥大相關(guān)基因的表達;1.3使用AAV9-sh RNA在小鼠體內(nèi)心肌特異性敲降A(chǔ)hit,檢測其對TAC誘導(dǎo)的心肌肥大的影響,心臟重量、超聲檢測心功能、WGA染色檢測心肌細胞面積、馬松染色心肌纖維化。第二章:2.1在NRCMs細胞中敲降和過表達Ahit,q RT-PCR和WB檢測鄰近基因MEF2A的表達變化;2.2使用RNA FISH和核質(zhì)分離檢測Ahit亞細胞分布;使用cat RAPID預(yù)測Ahit與PRC2復(fù)合物中蛋白組分的結(jié)合;使用RIP和RNA pulldown驗證Ahit與SUZ12的結(jié)合;2.3在NRCMs中使用Ch IP-PCR檢測敲降A(chǔ)hit后,SUZ12結(jié)合MEF2A啟動子區(qū)域的改變以及H3K27me3結(jié)合MEF2A啟動子區(qū)域的改變。結(jié)果:第一章lnc RNA Ahit的發(fā)現(xiàn)鑒定及其抑制心肌肥大的作用1.1使用lnc RNA表達譜芯片檢測TAC 2周后小鼠心臟差異性表達的lnc RNA,并用q RT-PCR驗證。其中l(wèi)nc RNA 4833412C05Rik在TAC過后顯著升高,我們將其命名為anti-hypertrophic interrelated transcript(Ahit)。Ahit具有物種間保守性,在人中的同源lnc RNA為LUNAR1,q RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)LUNAR1高表達于高血壓性心臟病患者的血清。1.2在NRCMs細胞中敲降A(chǔ)hit會加重PE誘導(dǎo)的心肌肥大及心肌肥大相關(guān)基因(ANP,BNP,β-MHC等)的表達;而過表達Ahit,會抑制PE誘導(dǎo)的心肌肥大并降低心肌肥大相關(guān)基因的表達。1.3使用AAV9-sh RNA在小鼠心臟中敲降A(chǔ)hit能夠加重TAC誘導(dǎo)的心肌肥大、心功能損傷以及心臟組織纖維化。第二章Ahit結(jié)合SUZ12抑制MEF2A基因表達進而保護心肌肥大2.1在NRCMs及小鼠心臟中敲降A(chǔ)hit,其鄰近基因MEF2A表達升高。敲降A(chǔ)hit同時敲降MEF2A,能夠抑制心肌肥大和相關(guān)基因表達,提示Ahit促進心肌肥大依賴于MEF2A。2.2 RNA FISH及核質(zhì)分離實驗表明Ahit主要分布在細胞核。使用cat RAPID預(yù)測Ahit與PRC2復(fù)合物中SUZ12結(jié)合能力最強,通過RIP及RNA pulldown證明二者的結(jié)合。2.3 SUZ12 Ch IP-PCR表明,在NRCMs細胞中敲降A(chǔ)hit后,SUZ12結(jié)合MEF2A啟動子區(qū)域減弱;相應(yīng)的MEF2A啟動子H3K27me3水平也降低。結(jié)論:1.1 lnc RNA Ahit在TAC刺激后代償性表達升高;1.2 Ahit能夠抑制PE及TAC誘導(dǎo)的心肌肥大;1.3 Ahit通過結(jié)合SUZ12誘導(dǎo)MEF2A啟動子區(qū)域H3K27me3,抑制MEF2A轉(zhuǎn)錄,進而抑制心肌肥大。
【學位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R54
【圖文】：

陸軍軍醫(yī)大學博士學位論文具體操作概括如下：1.3.2.1 測量前準備：在無人、安靜、溫暖的環(huán)境中，測量儀安裝在實驗臺而不是地面上，提前 20-30 分鐘讓大鼠適應(yīng)環(huán)境穩(wěn)定下來，開機加熱保溫器，測量時避免空調(diào)出風口等位置。輕柔抓取大鼠，通過訓(xùn)練讓每只大鼠適應(yīng)套筒。1.3.2.2 鼠袋的使用：鼠袋鼠網(wǎng)要與動物大小相符合。打開鼠袋，將鼠網(wǎng)放入保溫筒，再將保溫筒放入鼠袋，將信號線置于鼠袋下合適的位置，把右側(cè) A 片從右往左包住保溫筒，并將它固定在粘條 B 上。左手扶住鼠袋，前端朝下，右手將入口處的布片鋪開。右手抓好大鼠，使其頭部超前放入鼠袋，然后前端朝上，使用后側(cè)布條交纏包裹固定大鼠臀部，暴露出完整鼠尾。（圖 1-1）

陸軍軍醫(yī)大學博士學位論文。A10 細胞使用 MOI 50 的慢病毒感染，轉(zhuǎn)染時培養(yǎng)基加入 6 μg/mL polybrene 試劑高感染效率，加入病毒 24 小時后換液。培養(yǎng) 72 小時后，添加終濃度 10 mg/ml 的霉素用以篩選所有的被感染上的細胞（慢病毒感染細胞具有嘌呤霉素抗性），篩選后細胞傳代、凍存，提 RNA 使用 q-PCR 檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系干擾效率。操作步驟如下（圖 1-2）：

圖 1-3 蛋白濕轉(zhuǎn) PVDF 膜“三明治”組裝（4）固定好轉(zhuǎn)膜電泳盒，向內(nèi)槽中倒入 1×轉(zhuǎn)膜液，液面蓋過整個 “三明治”即可外槽加入雙蒸水用于降溫；整個轉(zhuǎn)膜盒放在冰水浴中。（5）轉(zhuǎn)膜條件：30V 常壓，2 小時。1.3.19.4 抗原封閉：（1）10×TBS 配制 (1 L) ：24 g Tris base , 88 g NaCl , 900 mL 雙蒸水溶解, 用 12Cl 調(diào) pH 至 7.6 ，雙蒸水補充至總體積 1 L。（2）封閉液配制：1×TBS 溶解 5% 脫脂奶粉。（3）1×TBST 洗膜液配制：1×TBS，0.1% Tween 20。（4）將膜放入封閉液中，搖床上，室溫封閉 1 小時。（5）1×TBST 洗膜 3 次，每次 5 分鐘。1.3.19.5 一抗孵育：

本文編號：2746748