【摘要】：研究背景動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的心血管疾病是目前全球各地區(qū)的第一死因,在西方國(guó)家,約有50%的人死于動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病及其引起的并發(fā)癥,而在多數(shù)醫(yī)療水平低下的國(guó)家,目前已經(jīng)超越了感染性疾病的危害。動(dòng)脈粥樣硬化可導(dǎo)致多種臨床表現(xiàn),包括短暫性腦缺血發(fā)作(Transient cerebral ischemic attacks,TIA)、主髂動(dòng)脈閉塞及冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease,CHD)等~([1])。雖然其臨床癥狀多樣,但病變本身具有普遍共性,即它們都表現(xiàn)為動(dòng)脈管壁大量膽固醇酯的沉積及復(fù)雜的進(jìn)展型斑塊的形成,最終導(dǎo)致動(dòng)脈相應(yīng)供血區(qū)缺血性改變~([2])。頸動(dòng)脈狹窄(carotid stenosis)因影響大腦血供而備受關(guān)注,其中90%由頸動(dòng)脈粥樣硬化引起,它能夠引起顱內(nèi)缺血并產(chǎn)生相應(yīng)的臨床癥狀,如黑蒙、視物模糊、偏癱失語(yǔ)等,致殘與致死率很高,患者一般無(wú)法自理,因而帶來(lái)巨大的社會(huì)及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。頸動(dòng)脈狹窄通常起病隱匿,往往出現(xiàn)腦缺血癥狀后才被發(fā)現(xiàn)。目前普遍認(rèn)為,導(dǎo)致腦缺血癥狀出現(xiàn)的原因主要有兩個(gè):一是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定,斑塊破裂或表面繼發(fā)的血栓脫落導(dǎo)致急性腦栓塞;二是動(dòng)脈狹窄造成遠(yuǎn)端腦組織血流低罐注。近年來(lái)研究表明,斑塊成分脫落是引起缺血性腦卒中最主要的原因,而顱內(nèi)動(dòng)脈低灌注導(dǎo)致卒中的較少~([3])。因此,研究頸動(dòng)脈斑塊穩(wěn)定性,探索早期預(yù)測(cè)不穩(wěn)定斑塊的生物標(biāo)記物及其作用機(jī)制具有重要意義,能夠有效降低腦卒中等不良事件的發(fā)生。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是長(zhǎng)度在200nt以上,不具備編碼蛋白質(zhì)功能的RNA。許多研究結(jié)果證實(shí),多種lncRNA在血管疾病中發(fā)揮重要作用,在動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的發(fā)生及進(jìn)展中,lncRNA通過(guò)調(diào)節(jié)血管壁功能、激活巨噬細(xì)胞、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝及免疫炎癥反應(yīng)等多個(gè)環(huán)節(jié)調(diào)控疾病的發(fā)生與進(jìn)展~([4])。但目前尚無(wú)明確報(bào)道lncRNA在頸動(dòng)脈斑塊穩(wěn)定性中的作用及機(jī)制。研究目的我中心前期應(yīng)用基因芯片的方法,得到了穩(wěn)定及不穩(wěn)定頸動(dòng)脈斑塊中差異表達(dá)的lncRNA及mRNA,其中l(wèi)ncASAP2-7:1差異表達(dá)倍數(shù)高,我們選擇lncASAP2-7:1作為深入研究的靶標(biāo),下一步將驗(yàn)證lncASAP2-7:1在不同穩(wěn)定性頸動(dòng)脈斑塊中的差異性表達(dá),并檢測(cè)斑塊中l(wèi)ncASAP2-7:1含量與纖維帽厚度及脂質(zhì)核心區(qū)等斑塊主要成分的相關(guān)性。利用基因芯片結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析,預(yù)測(cè)lncASAP2-7:1的生物學(xué)功能,進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證lncASAP2-7:1在調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞功能中的作用及可能的作用機(jī)制,進(jìn)而說(shuō)明lncASAP2-7:1在斑塊穩(wěn)定性中發(fā)揮的調(diào)控作用。研究方法(1)臨床樣本研究:收集2015年8月至2016年12月年于海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院住院行頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)(carotid endanerectomy,CEA)患者的頸動(dòng)脈斑塊標(biāo)本。將收集到的頸動(dòng)脈斑塊標(biāo)本切成小段分開(kāi)保存,一部分標(biāo)本液氮凍存用于取斑塊中RNA,通過(guò)real time PCR驗(yàn)證基因芯片中l(wèi)ncASAP2-7:1差異性;一部分存放于福爾馬林溶液中,然后石蠟包埋切片行HE染色,電鏡掃判斷斑塊穩(wěn)定性、測(cè)量纖維帽厚度及脂質(zhì)核心區(qū)面積等。最后,統(tǒng)計(jì)分析斑塊中l(wèi)ncASAP2-7:1相對(duì)表達(dá)量與斑塊成分之間的相關(guān)性。利用基因芯片結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析,預(yù)測(cè)lncASAP2-7:1可能的生物學(xué)功能。醫(yī)院倫理審查委員會(huì)評(píng)審并批準(zhǔn)了此項(xiàng)研究,所有患者均知情同意。(2)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究:包裝lncASAP2-7:1過(guò)表達(dá)及干擾的慢病毒,通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分組為lncASAP2-7:1上調(diào)組、上調(diào)對(duì)照組、下調(diào)組、下調(diào)對(duì)照組及正�？瞻讓�(duì)照組。采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)lncASAP2-7:1調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞的遷移功能,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定Ⅰ型膠原蛋白含量,進(jìn)而反映lncASAP2-7:1調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞合成分泌蛋白的功能,采用流式凋亡檢測(cè)lncASAP2-7:1調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞凋亡功能,CCK8(Cell Counting Kit-8)及流式細(xì)胞周期檢測(cè)lncASAP2-7:1調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞增殖功能。結(jié)果1.臨床樣本研究:收集2015年8月至2016年12月于長(zhǎng)海醫(yī)院血管外科行頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)的頸動(dòng)脈斑塊標(biāo)本22例,其中不穩(wěn)定斑塊11例,穩(wěn)定斑塊11例。不穩(wěn)定斑塊lncASAP2-7:1相對(duì)表達(dá)量為6.679±5.883,穩(wěn)定斑塊lncASAP2-7:1相對(duì)表達(dá)量為1.192±0.583,Real-time PCR結(jié)果示lncASAP2-7:1在不穩(wěn)定斑塊中的相對(duì)表達(dá)量明顯高于穩(wěn)定斑塊(p0.0001)。不穩(wěn)定斑塊纖維帽厚度為120.80±31.29μm,穩(wěn)定斑塊纖維帽厚度為163.51±34.34μm,不穩(wěn)定斑塊脂核所占比例為33.45%±9.76%,穩(wěn)定斑塊脂核所占比例為27.84%±7.38%。穩(wěn)定斑塊纖維帽厚度明顯高于不穩(wěn)定斑塊(p0.01),兩組斑塊脂核所占比例無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。頸動(dòng)脈斑塊中l(wèi)ncASAP2-7:1相對(duì)表達(dá)量與纖維帽厚度存在負(fù)相關(guān)(r=-0.667,p0.01),與脂核所占比例無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.340,p0.05)。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果示,lncASAP2-7:1可能參與了細(xì)胞遷移、分泌及細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等生物學(xué)過(guò)程。(2)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究:利用包裝lncASAP2-7:1過(guò)表達(dá)及干擾的慢病毒干預(yù)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞,分別驗(yàn)證了血管平滑肌細(xì)胞的遷移、分泌、增殖、凋亡功能,發(fā)現(xiàn)lncASAP2-7:1高表達(dá)可以明顯抑制血管平滑肌的遷移及I型膠原蛋白的合成,在細(xì)胞增殖及凋亡中無(wú)明顯作用。結(jié)論lncASAP2-7:1在不穩(wěn)定斑塊中表達(dá)量明顯高于穩(wěn)定斑塊且與斑塊中纖維帽厚度呈負(fù)相關(guān),細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)lncASAP2-7:1高表達(dá)抑制了血管平滑肌細(xì)胞的遷移及分泌I型膠原蛋白的功能,影響了纖維帽的厚度,導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定,繼發(fā)腦卒中等不良事件。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R543.4
【圖文】：

lncASAP2-7:1 在頸動(dòng)脈斑塊穩(wěn)定性中的作用細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)），血管平滑肌細(xì)胞及膠原蛋白含塊內(nèi)出血、鈣化程度及部位、斑塊大小是否容易引起斑塊不穩(wěn)定[19]。

集行 CEA 手術(shù)患者的頸動(dòng)脈斑塊標(biāo)本（圖 1 所示），結(jié)合上述不穩(wěn)定斑標(biāo)本 HE 染色行組織病理學(xué)分析（圖 2 所示），篩選出 11 例穩(wěn)定斑塊，斑塊，用于斑塊成分測(cè)量及 real time PCR 驗(yàn)證 lncASAP2-7:1 差異表達(dá)量時(shí)選取狹窄程度最嚴(yán)重部位的切片，用 Caseviewer 軟件測(cè)量斑塊纖維核所占比例，纖維帽厚度取最薄處進(jìn)行測(cè)量[7]（圖 3 所示）。不穩(wěn)定斑度為 120.80±31.29μm，穩(wěn)定斑塊纖維帽厚度為 163.51±34.34μm，不穩(wěn)定占比例為 33.45%±9.76%，穩(wěn)定斑塊脂核所占比例為 27.84%±7.38%。所圖 2 頸動(dòng)脈斑塊 HE染色定斑塊，斑塊中僅見(jiàn)較小面積的脂核區(qū)；(B)不穩(wěn)定斑塊，斑塊內(nèi)可見(jiàn)巨大）、斑塊內(nèi)出血（IPH）及表面血栓形成（T）； LC: liqid core, FC: fibtraplaque hemorrhage, T: thrombus

Real time PCR 驗(yàn)證 lncASAP2-7:1 差異性表P2-7:1 引物序列imer ACATTGTCTTAACCTCGTACTCTimer ACCGCTTATTCAGCCACACA果織病理學(xué)方法確定頸動(dòng)脈斑塊穩(wěn)定性，分別選取 11 例穩(wěn)進(jìn)行 real time PCR 驗(yàn)證，以人 GAPDH 作為內(nèi)參引物。實(shí)均值反應(yīng)其相對(duì)表達(dá)量。圖 3 頸動(dòng)脈斑塊成分測(cè)量圖解域?yàn)橹|(zhì)核心區(qū)面積（黃色方框內(nèi)為測(cè)量值），箭頭所指部位為纖框內(nèi)為測(cè)量值）

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 秦鋒;孫羽東;周建;趙志青;;頸動(dòng)脈斑塊穩(wěn)定性影像學(xué)評(píng)估的研究進(jìn)展[J];中國(guó)血管外科雜志(電子版);2015年02期

2 莊瑜;劉俊;肖明第;;血管平滑肌細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2009年17期

本文編號(hào)：2746401