【摘要】：背景:冠心病是威脅人類生命健康的主要疾病之一,其病理機制為冠狀動脈管腔狹窄或閉塞導(dǎo)致心肌細胞缺血缺氧,持續(xù)性地缺血缺氧可使心肌細胞壞死,從而影響心臟收縮功能、傳導(dǎo)功能,甚至發(fā)生猝死可能。很多研究證實氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、自噬、凋亡等多種因素參與心肌細胞缺氧損傷的病理過程,分子機制方面已取得了相當(dāng)大的進展,但其具體作用機制仍然是非常復(fù)雜的。所以研究者們致力于新的治療靶點的開發(fā)并應(yīng)用于臨床,從而為人類健康謀取福祉。B細胞淋巴瘤6(B-cell lymphoma 6,Bcl6)是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子,作為調(diào)控B細胞生長發(fā)育的調(diào)節(jié)因子,在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。很多研究證實,Bcl6在氧化應(yīng)激、細胞凋亡中起重要作用,參與許多其他疾病的發(fā)生,但目前尚無關(guān)于Bcl6在心肌細胞缺氧損傷中的作用的研究。鑒于此,我們提出了假設(shè),Bcl6可能參與了心肌缺血損傷的病理過程,而且可能成為心肌缺血損傷的一個治療靶點。本課題旨在于闡明Bcl6對心肌細胞缺氧損傷的作用及內(nèi)在機制,為探索心肌細胞缺血缺氧的保護措施及冠心病的藥物開發(fā)、臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。目的:研究Bcl6對心肌細胞缺氧損傷的作用,并對其可能機制進行初步探索。方法:分別使用Bcl6-si RNA和陰性對照si RNA轉(zhuǎn)染H9c2大鼠心肌細胞,制作缺氧箱模型(95%的N2和5%的CO2),把預(yù)處理后的細胞分別放置在常氧和缺氧環(huán)境中24h,分為四組:si RNA常氧組,si Bcl6常氧組,si RNA缺氧組和si Bcl6缺氧組。蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)檢測各組Bcl6的表達,實時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測炎癥因子水平(TNFα,IL-1,IL-6)。使用MTT試劑盒檢測心肌細胞存活率。流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)ROS水平。使用Western blot檢測抗氧化物蛋白的表達。TUNEL染色檢測細胞凋亡率。為了探討B(tài)cl6對心肌細胞缺氧損傷作用的潛在機制,我們使用Western blot檢測各組P38、JNK、ERK的表達,并分別使用P38、JNK、ERK抑制劑處理細胞,驗證是否能逆轉(zhuǎn)表型。結(jié)果:Bcl6敲減后增加了炎癥因子的表達,降低了細胞存活率。當(dāng)細胞給予缺氧處理后,氧化應(yīng)激水平增加,而Bcl6敲減進一步增加了氧化應(yīng)激。通過TUNEL染色發(fā)現(xiàn),Bcl6敲減后細胞凋亡率增加。在常氧和缺氧狀態(tài)下,Bcl6敲減后均下調(diào)了抗凋亡蛋白Bcl2的表達,而促凋亡蛋白Bax的表達上調(diào),cytochrome C的表達增加。在常氧狀態(tài)下,Bcl6敲減使P38磷酸化水平升高,而不影響JNK和ERK磷酸化,細胞暴露于缺氧后,P38、JNK、ERK的磷酸化水平升高。有趣的是,在缺氧狀態(tài)下,Bcl6敲減僅僅增加了P38磷酸化水平。為了驗證Bcl6是通過P38信號通路發(fā)揮作用,我們先用si Bcl6預(yù)處理H9c2細胞,然后分別加入P38、JNK、ERK抑制劑,放置缺氧箱24h,Western blot結(jié)果顯示,只有P38抑制劑可以逆轉(zhuǎn)Bcl6敲減介導(dǎo)的細胞表型,與si Bcl6對照組相比較,P38抑制劑組的細胞炎癥因子水平、ROS水平明顯降低,細胞存活率增加。結(jié)論:Bcl6敲減后通過P38信號通路導(dǎo)致炎癥、氧化應(yīng)激和細胞凋亡,加重缺氧引起的心肌細胞損傷。因此,Bcl6可能參與心肌細胞的生理病理過程,可以作為心血管疾病的一個新的治療靶點。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R54
【圖文】：

與對照 siRNA 組相比，* P < 0.05圖 1 Bcl6 siRNA 和對照 siRNA 轉(zhuǎn)染后 B2 Bcl6 敲減后細胞存活率下降應(yīng)用 MTT 法檢測細胞存活率。通過陰性 siRNA 敲

MTT法測四

與 siRNA 常氧組相比，* P < 0.05；與 siRNA 缺氧組相比，# P < 0.05。圖 3 四組細胞促炎性細胞因子 TNF- 、IL-1 和 IL-6 的 mRNA 表達水平4 Bcl6 敲減后心肌細胞的氧化應(yīng)激水平增高當(dāng)細胞缺氧 24h 后，NADPH 氧化酶亞基 p67 和 gp91 的 mRNA 表達水平明

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 趙伯明;楊操;;條件性RNA干擾在基因治療中的研究進展[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2014年04期

2 任澎;張巍;劉永國;李U

本文編號：2746328