發(fā)布時(shí)間：2020-07-08 08:27

【摘要】：背景:冠心病是威脅人類生命健康的主要疾病之一,其病理機(jī)制為冠狀動(dòng)脈管腔狹窄或閉塞導(dǎo)致心肌細(xì)胞缺血缺氧,持續(xù)性地缺血缺氧可使心肌細(xì)胞壞死,從而影響心臟收縮功能、傳導(dǎo)功能,甚至發(fā)生猝死可能。很多研究證實(shí)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、自噬、凋亡等多種因素參與心肌細(xì)胞缺氧損傷的病理過(guò)程,分子機(jī)制方面已取得了相當(dāng)大的進(jìn)展,但其具體作用機(jī)制仍然是非常復(fù)雜的。所以研究者們致力于新的治療靶點(diǎn)的開(kāi)發(fā)并應(yīng)用于臨床,從而為人類健康謀取福祉。B細(xì)胞淋巴瘤6(B-cell lymphoma 6,Bcl6)是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子,作為調(diào)控B細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)因子,在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。很多研究證實(shí),Bcl6在氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡中起重要作用,參與許多其他疾病的發(fā)生,但目前尚無(wú)關(guān)于Bcl6在心肌細(xì)胞缺氧損傷中的作用的研究。鑒于此,我們提出了假設(shè),Bcl6可能參與了心肌缺血損傷的病理過(guò)程,而且可能成為心肌缺血損傷的一個(gè)治療靶點(diǎn)。本課題旨在于闡明Bcl6對(duì)心肌細(xì)胞缺氧損傷的作用及內(nèi)在機(jī)制,為探索心肌細(xì)胞缺血缺氧的保護(hù)措施及冠心病的藥物開(kāi)發(fā)、臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目的:研究Bcl6對(duì)心肌細(xì)胞缺氧損傷的作用,并對(duì)其可能機(jī)制進(jìn)行初步探索。方法:分別使用Bcl6-si RNA和陰性對(duì)照si RNA轉(zhuǎn)染H9c2大鼠心肌細(xì)胞,制作缺氧箱模型(95%的N2和5%的CO2),把預(yù)處理后的細(xì)胞分別放置在常氧和缺氧環(huán)境中24h,分為四組:si RNA常氧組,si Bcl6常氧組,si RNA缺氧組和si Bcl6缺氧組。蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)檢測(cè)各組Bcl6的表達(dá),實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測(cè)炎癥因子水平(TNFα,IL-1,IL-6)。使用MTT試劑盒檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。使用Western blot檢測(cè)抗氧化物蛋白的表達(dá)。TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。為了探討B(tài)cl6對(duì)心肌細(xì)胞缺氧損傷作用的潛在機(jī)制,我們使用Western blot檢測(cè)各組P38、JNK、ERK的表達(dá),并分別使用P38、JNK、ERK抑制劑處理細(xì)胞,驗(yàn)證是否能逆轉(zhuǎn)表型。結(jié)果:Bcl6敲減后增加了炎癥因子的表達(dá),降低了細(xì)胞存活率。當(dāng)細(xì)胞給予缺氧處理后,氧化應(yīng)激水平增加,而B(niǎo)cl6敲減進(jìn)一步增加了氧化應(yīng)激。通過(guò)TUNEL染色發(fā)現(xiàn),Bcl6敲減后細(xì)胞凋亡率增加。在常氧和缺氧狀態(tài)下,Bcl6敲減后均下調(diào)了抗凋亡蛋白Bcl2的表達(dá),而促凋亡蛋白Bax的表達(dá)上調(diào),cytochrome C的表達(dá)增加。在常氧狀態(tài)下,Bcl6敲減使P38磷酸化水平升高,而不影響JNK和ERK磷酸化,細(xì)胞暴露于缺氧后,P38、JNK、ERK的磷酸化水平升高。有趣的是,在缺氧狀態(tài)下,Bcl6敲減僅僅增加了P38磷酸化水平。為了驗(yàn)證Bcl6是通過(guò)P38信號(hào)通路發(fā)揮作用,我們先用si Bcl6預(yù)處理H9c2細(xì)胞,然后分別加入P38、JNK、ERK抑制劑,放置缺氧箱24h,Western blot結(jié)果顯示,只有P38抑制劑可以逆轉(zhuǎn)Bcl6敲減介導(dǎo)的細(xì)胞表型,與si Bcl6對(duì)照組相比較,P38抑制劑組的細(xì)胞炎癥因子水平、ROS水平明顯降低,細(xì)胞存活率增加。結(jié)論:Bcl6敲減后通過(guò)P38信號(hào)通路導(dǎo)致炎癥、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡,加重缺氧引起的心肌細(xì)胞損傷。因此,Bcl6可能參與心肌細(xì)胞的生理病理過(guò)程,可以作為心血管疾病的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R54
【圖文】：

與對(duì)照 siRNA 組相比，* P < 0.05圖 1 Bcl6 siRNA 和對(duì)照 siRNA 轉(zhuǎn)染后 B2 Bcl6 敲減后細(xì)胞存活率下降應(yīng)用 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活率。通過(guò)陰性 siRNA 敲

MTT法測(cè)四

與 siRNA 常氧組相比，* P < 0.05；與 siRNA 缺氧組相比，# P < 0.05。圖 3 四組細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子 TNF- 、IL-1 和 IL-6 的 mRNA 表達(dá)水平4 Bcl6 敲減后心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平增高當(dāng)細(xì)胞缺氧 24h 后，NADPH 氧化酶亞基 p67 和 gp91 的 mRNA 表達(dá)水平明

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 趙伯明;楊操;;條件性RNA干擾在基因治療中的研究進(jìn)展[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2014年04期

2 任澎;張巍;劉永國(guó);李U

本文編號(hào)：2746328