發(fā)布時(shí)間：2020-07-07 20:13

【摘要】：研究背景及目的急性心肌梗死引起心肌細(xì)胞缺血缺氧性損害,出現(xiàn)程序性凋亡或壞死,產(chǎn)生左室病理性擴(kuò)張及左室射血分?jǐn)?shù)降低。心肌細(xì)胞再生能力有限導(dǎo)致心肌梗死區(qū)的死亡心肌細(xì)胞被成纖維細(xì)胞替代,產(chǎn)生無收縮功能的膠原瘢痕組織,最終導(dǎo)致缺血性心肌病、心力衰竭的發(fā)生。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)治療急性心肌梗死的治療效果已在許多大型靈長類動物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)中得到證實(shí)。MSCs具有低免疫原性、多向分化潛能、干性維持及獲取方便等優(yōu)勢。但是,心梗后不利的微環(huán)境導(dǎo)致移植到心梗周邊區(qū)的細(xì)胞存活率很低,這成為MSCs有效治療的瓶頸。我們團(tuán)隊(duì)以往的研究發(fā)現(xiàn)缺氧預(yù)處理(hypoxia preconditioning,HP)的MSCs的存活能力明顯增強(qiáng),通過對正常培養(yǎng)的MSCs和缺氧預(yù)處理MSCs兩組細(xì)胞的基因組芯片分析,發(fā)現(xiàn)缺氧預(yù)處理能明顯上調(diào)MSCs的瘦素(leptin)水平,并且提出瘦素可能參與了 MSCs治療心肌梗死的作用。然而,瘦素是否通過獨(dú)立保護(hù)MSCs抗凋亡而促進(jìn)其療效以及相應(yīng)的分子機(jī)制尚不清楚。為此,本博士研究課題將首先著力于證實(shí)瘦素是否具有保護(hù)MSCs抗凋亡的作用。線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和穩(wěn)態(tài)的維持是細(xì)胞存活的必要條件。線粒體脊結(jié)構(gòu)破壞將導(dǎo)致其中富含的許多前凋亡因子從線粒體中釋放到胞漿,而啟動凋亡信號通路。線粒體穩(wěn)態(tài)(融合與分裂)的動態(tài)平衡是維持正常細(xì)胞線粒體功能的重要條件,線粒體分裂有利于清除細(xì)胞內(nèi)受損的線粒體,但過度分裂也會啟動線粒體自噬導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。瘦素是脂肪細(xì)胞分泌的肽類激素,在平衡能量代謝、神經(jīng)內(nèi)分泌及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)方面都有廣泛作用。許多研究發(fā)現(xiàn)瘦素對線粒體有潛在調(diào)控作用。在乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)中給予瘦素處理后,發(fā)現(xiàn)線粒體的動力學(xué)穩(wěn)態(tài)和功能有著明顯改善;瘦素這一線粒體調(diào)控作用在瘦素缺失的ob/ob小鼠中也得到進(jìn)一步證實(shí)。已有文獻(xiàn)提出瘦素對心肌細(xì)胞的抗凋亡保護(hù)作用。因此,本博士論文課題同時(shí)也將就瘦素是否同樣通過對MSCs線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)及其穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)而發(fā)揮抗凋亡而保護(hù)MSCs的生存展開研究。第一部分:在體內(nèi)和體外模型中驗(yàn)證瘦素對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的存活能力的影響目的:在體內(nèi)和體外模型中驗(yàn)證瘦素對MSCs的存活能力有無影響方法與結(jié)果:在體實(shí)驗(yàn)部分,首先,分離培養(yǎng)人骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs),并利用帶有GFP標(biāo)記瘦素過表達(dá)質(zhì)粒的慢病毒感染hMSCs過表達(dá)瘦素,以便將過表達(dá)瘦素的hMSCs移植到急性心梗C57BL/6J小鼠心臟治療備用。我們將C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為三組(每組20只):Ⅰ)心肌梗死(MI)組小鼠給予瘦素過表達(dá)hMSCs治療(hMSClep);Ⅱ)MI組小鼠給予同等細(xì)胞數(shù)量病毒質(zhì)粒載體感染hMSCs治療(hMSCvec);Ⅲ)MI組小鼠給予相同注射體積的DMEM組。我們的結(jié)果顯示:Ⅰ)在心梗術(shù)后3天取材小鼠心臟,切片熒光共染GFP和TUNEL評估hMSCs存活率。與病毒空載組(vector)相比較,移植病毒過表達(dá)瘦素的hMSCs組中的hMSCs細(xì)胞存活率明顯提高(p=0.01)。Ⅱ)在心梗后28天進(jìn)行超聲心動圖檢測心功能和天狼星紅染色評價(jià)梗死面積發(fā)現(xiàn),瘦素過表達(dá)hMSCs組小鼠的心功能和梗死面積均較對照組有明顯緩解。通過術(shù)后28天檢測血管新生相關(guān)標(biāo)記物提示:hMSCs是通過旁分泌效應(yīng)增強(qiáng)血管新生而改善心梗后心功能。體外實(shí)驗(yàn)建立缺糖缺氧缺血清(glucose and serum deprivation under hypoxia,GSDH)的hMSCs誘導(dǎo)凋亡模型模擬在體心梗體內(nèi)不良微環(huán)境。在常氧下將hMSCs給予瘦素(50 ng/ml)預(yù)處理24小時(shí)后,再暴露于GSDH刺激24小時(shí)。通過Annexin V/PI染色、TUNEL染色和剪切型caspase 3凋亡蛋白的檢測,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,瘦素預(yù)處理hMSCs組的細(xì)胞在凋亡應(yīng)激環(huán)境中的抗凋亡能力明顯增強(qiáng)。我們收集細(xì)胞培養(yǎng)的條件上清液,進(jìn)行HUVEC細(xì)胞的matrigal管腔形成實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)與對照組相比,瘦素預(yù)處理hMSCs組的條件上清液使HUVEC細(xì)胞管腔形成最明顯,進(jìn)一步證實(shí)hMSCs的旁分泌效應(yīng)。第二部分:在體外研究瘦素對間充質(zhì)干細(xì)胞的線粒體動力及功能的改變及其機(jī)制探索目的:線粒體是細(xì)胞凋亡中重要的細(xì)胞器,通過分析線粒體結(jié)構(gòu)和動力的相關(guān)調(diào)控因子,進(jìn)一步探索瘦素對hMSCs的線粒體改變的機(jī)制方法與結(jié)果:在預(yù)處理瘦素(50ng/ml)24小時(shí)后,再將hMSCs進(jìn)行GSDH誘導(dǎo)凋亡24小時(shí)。通過細(xì)胞透射電鏡觀察hMSCs的超微結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)瘦素預(yù)處理hMSCs中的線粒體明顯增粗增長、脊膨脹;而對照組的線粒體形態(tài)則是稀疏、短小的點(diǎn)狀樣。但是細(xì)胞氧耗量的檢測發(fā)現(xiàn)瘦素預(yù)處理組的hMSCs比對照組明顯減少,提示我們在凋亡模型中瘦素只對線粒體形態(tài)的完整性有保護(hù)作用,而對改善線粒體的氧化磷酸化功能沒有作用。進(jìn)一步分析線粒體動力相關(guān)因子,發(fā)現(xiàn)在瘦素預(yù)處理hMCSs組中,線粒體上調(diào)控內(nèi)膜融合與分裂的因子Optic atrophy 1(OPA1)的蛋白水平明顯上調(diào),但在基因水平無變化。OPA1是與動力相關(guān)GTP酶樣蛋白,位于線粒體內(nèi)膜上,調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)膜的融合與分裂、維持脊結(jié)構(gòu)。OPA1有至少5個(gè)亞型,主要為長亞型(a、b)和短亞型(c、d、e)。有趣的是,長亞型OPA1(L-OPA1)和短亞型OPA1(S-OPA1)的功能截然相反,L-OPA1調(diào)控線粒體內(nèi)膜融合,S-OPA1控制線粒體內(nèi)膜分裂。我們發(fā)現(xiàn),在瘦素預(yù)處理組的hMSCs中的L-OPA1明顯增多,這符合電鏡下觀察到的線粒體增粗延長,提示線粒體的病理性融合。通過siRNA進(jìn)行細(xì)胞OPA1的特異性基因沉默方式,證實(shí)瘦素對hMSCs的抗凋亡保護(hù)作用依賴于OPA1因子。進(jìn)一步分析調(diào)控OPA1的因子后發(fā)現(xiàn),在瘦素預(yù)處理hMSCs組,另一個(gè)線粒體內(nèi)膜蛋白OMA1的降解增多。已有文獻(xiàn)報(bào)道,OMA1對OPA1有負(fù)性調(diào)節(jié)作用,OMA1的降解增加符合上述觀察到的OPA1的蛋白水平表達(dá)增多。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)瘦素通過GSK3磷酸化激活而啟動OMA1的泛素化降解途徑,并且給予GSK3的抑制劑(SB216763)阻止了 OMA1的降解作用,提示OMA1的泛素化降解依賴于GSK3磷酸化激活。結(jié)論:在急性心肌梗死后的惡劣的微環(huán)境中,1)瘦素能夠通過維持線粒體脊結(jié)構(gòu)的完整性而增強(qiáng)hMSCs的抗凋亡能力;2)瘦素通過依賴于GSK3磷酸化的方式而介導(dǎo)OMA1的泛素化降解,從而減少OMA1對OPA1的剪切而使OPA1的蛋白表達(dá)水平增多,促使線粒體融合。我們提出了,瘦素通過作用于GSK3/OMA1/OPA1信號通路而增強(qiáng)hMSCs應(yīng)激時(shí)的抗凋亡能力,為心血管疾病的干細(xì)胞治療提供新的靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R542.22
【圖文】：

表達(dá)確定逡逑首先，我們對體外培養(yǎng)的ｈＭＳＣｓ進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞大部分為紡錘形，逡逑呈全貼壁狀，細(xì)胞核呈圓形位于細(xì)胞中心（圖１Ａ）。進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)鑒定，分析逡逑細(xì)胞的表面特異性陽性抗體和陰性抗體（圖１Ｂ），確定了邋ｈＭＳＣｓ的細(xì)胞特性。通逡逑過提取正常培養(yǎng)ｈＭＳＣｓ的細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測明確ｈＭＳＣｓ有瘦素逡逑受體表達(dá)（圖２）。逡逑：逡逑：ｉｒｎ邋：ｆｆｎ邋：ｒｆｎ逡逑Ｈ邋Ｉ邋１邋；邐１邋ｄ邋‘逡逑ｔｔ＊邐＊＊■＊■逡逑圖１邋ｈＭＳＣｓ的細(xì)胞形態(tài)及表面特異性標(biāo)記物鑒定６Ｕ相差光學(xué)顯逡逑微鏡下第４－８代ｈＭＳＣｓ生長至９０％融合度時(shí)的形態(tài)。６５」流式細(xì)胞鑒逡逑定，橫坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)量。逡逑ＯｂＲ逡逑ｐ－ａｃｔｉｎ邋ｒｎｍｍｍ邐４３逡逑ｋＤａ逡逑圖２在ｈＭＳＣｓ中有瘦素受體表徸通過Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ檢測ｈＭＳＣｓ中有逡逑瘦素受體表徸。逡逑１９逡逑

細(xì)胞的表面特異性陽性抗體和陰性抗體（圖１Ｂ），確定了邋ｈＭＳＣｓ的細(xì)胞特性。通逡逑過提取正常培養(yǎng)ｈＭＳＣｓ的細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測明確ｈＭＳＣｓ有瘦素逡逑受體表達(dá)（圖２）。逡逑：逡逑：ｉｒｎ邋：ｆｆｎ邋：ｒｆｎ逡逑Ｈ邋Ｉ邋１邋；邐１邋ｄ邋‘逡逑ｔｔ＊邐＊＊■＊■逡逑圖１邋ｈＭＳＣｓ的細(xì)胞形態(tài)及表面特異性標(biāo)記物鑒定６Ｕ相差光學(xué)顯逡逑微鏡下第４－８代ｈＭＳＣｓ生長至９０％融合度時(shí)的形態(tài)。６５」流式細(xì)胞鑒逡逑定，橫坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)量。逡逑ＯｂＲ逡逑ｐ－ａｃｔｉｎ邋ｒｎｍｍｍ邐４３逡逑ｋＤａ逡逑圖２在ｈＭＳＣｓ中有瘦素受體表徸通過Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ檢測ｈＭＳＣｓ中有逡逑瘦素受體表徸。逡逑１９逡逑

光報(bào)告基團(tuán)，慢病毒過表達(dá)瘦素基因感染ｈＭＳＣｓ４８小時(shí)后，在倒置熒光顯微鏡下逡逑觀察，在瘦素過表徸基因組與質(zhì)�？蛰d組的ＧＦＰ熒光強(qiáng)度相似，感染效率均達(dá)９０％逡逑以上（圖３Ａ）。然后提取細(xì)胞總蛋白，通過Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ檢測證實(shí)，與質(zhì)�？蛰d組逡逑相比，在過表達(dá)瘦素基因姐的瘦素蛋白水平明顯上調(diào)，并檢測到ｆｌａｇ標(biāo)簽蛋白（圖逡逑３Ｂ）0逡逑Ａ逡逑＿＿＿＿＿＿＿邋ｈＭＳＣｖｅｃ邐邐邋ｈＭＳＣｉｅｐ逡逑W逡逑Ｂ逡逑ｈＭＳＣｖｅｃ邋ｈＭＳＣｉｅｐ逡逑Ｆｌａｇ＾邐１９逡逑丨ｅｐ邋？贈、霸

本文編號：2745557