發(fā)布時間：2020-07-07 20:13

【摘要】：研究背景及目的急性心肌梗死引起心肌細胞缺血缺氧性損害,出現(xiàn)程序性凋亡或壞死,產(chǎn)生左室病理性擴張及左室射血分數(shù)降低。心肌細胞再生能力有限導致心肌梗死區(qū)的死亡心肌細胞被成纖維細胞替代,產(chǎn)生無收縮功能的膠原瘢痕組織,最終導致缺血性心肌病、心力衰竭的發(fā)生。骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)治療急性心肌梗死的治療效果已在許多大型靈長類動物實驗及臨床試驗中得到證實。MSCs具有低免疫原性、多向分化潛能、干性維持及獲取方便等優(yōu)勢。但是,心梗后不利的微環(huán)境導致移植到心梗周邊區(qū)的細胞存活率很低,這成為MSCs有效治療的瓶頸。我們團隊以往的研究發(fā)現(xiàn)缺氧預處理(hypoxia preconditioning,HP)的MSCs的存活能力明顯增強,通過對正常培養(yǎng)的MSCs和缺氧預處理MSCs兩組細胞的基因組芯片分析,發(fā)現(xiàn)缺氧預處理能明顯上調(diào)MSCs的瘦素(leptin)水平,并且提出瘦素可能參與了 MSCs治療心肌梗死的作用。然而,瘦素是否通過獨立保護MSCs抗凋亡而促進其療效以及相應的分子機制尚不清楚。為此,本博士研究課題將首先著力于證實瘦素是否具有保護MSCs抗凋亡的作用。線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和穩(wěn)態(tài)的維持是細胞存活的必要條件。線粒體脊結(jié)構(gòu)破壞將導致其中富含的許多前凋亡因子從線粒體中釋放到胞漿,而啟動凋亡信號通路。線粒體穩(wěn)態(tài)(融合與分裂)的動態(tài)平衡是維持正常細胞線粒體功能的重要條件,線粒體分裂有利于清除細胞內(nèi)受損的線粒體,但過度分裂也會啟動線粒體自噬導致細胞凋亡。瘦素是脂肪細胞分泌的肽類激素,在平衡能量代謝、神經(jīng)內(nèi)分泌及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)方面都有廣泛作用。許多研究發(fā)現(xiàn)瘦素對線粒體有潛在調(diào)控作用。在乳腺癌細胞(MCF-7)中給予瘦素處理后,發(fā)現(xiàn)線粒體的動力學穩(wěn)態(tài)和功能有著明顯改善;瘦素這一線粒體調(diào)控作用在瘦素缺失的ob/ob小鼠中也得到進一步證實。已有文獻提出瘦素對心肌細胞的抗凋亡保護作用。因此,本博士論文課題同時也將就瘦素是否同樣通過對MSCs線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)及其穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)而發(fā)揮抗凋亡而保護MSCs的生存展開研究。第一部分:在體內(nèi)和體外模型中驗證瘦素對骨髓間充質(zhì)干細胞的存活能力的影響目的:在體內(nèi)和體外模型中驗證瘦素對MSCs的存活能力有無影響方法與結(jié)果:在體實驗部分,首先,分離培養(yǎng)人骨髓來源的間充質(zhì)干細胞(hMSCs),并利用帶有GFP標記瘦素過表達質(zhì)粒的慢病毒感染hMSCs過表達瘦素,以便將過表達瘦素的hMSCs移植到急性心梗C57BL/6J小鼠心臟治療備用。我們將C57BL/6J小鼠隨機分為三組(每組20只):Ⅰ)心肌梗死(MI)組小鼠給予瘦素過表達hMSCs治療(hMSClep);Ⅱ)MI組小鼠給予同等細胞數(shù)量病毒質(zhì)粒載體感染hMSCs治療(hMSCvec);Ⅲ)MI組小鼠給予相同注射體積的DMEM組。我們的結(jié)果顯示:Ⅰ)在心梗術(shù)后3天取材小鼠心臟,切片熒光共染GFP和TUNEL評估hMSCs存活率。與病毒空載組(vector)相比較,移植病毒過表達瘦素的hMSCs組中的hMSCs細胞存活率明顯提高(p=0.01)。Ⅱ)在心梗后28天進行超聲心動圖檢測心功能和天狼星紅染色評價梗死面積發(fā)現(xiàn),瘦素過表達hMSCs組小鼠的心功能和梗死面積均較對照組有明顯緩解。通過術(shù)后28天檢測血管新生相關(guān)標記物提示:hMSCs是通過旁分泌效應增強血管新生而改善心梗后心功能。體外實驗建立缺糖缺氧缺血清(glucose and serum deprivation under hypoxia,GSDH)的hMSCs誘導凋亡模型模擬在體心梗體內(nèi)不良微環(huán)境。在常氧下將hMSCs給予瘦素(50 ng/ml)預處理24小時后,再暴露于GSDH刺激24小時。通過Annexin V/PI染色、TUNEL染色和剪切型caspase 3凋亡蛋白的檢測,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,瘦素預處理hMSCs組的細胞在凋亡應激環(huán)境中的抗凋亡能力明顯增強。我們收集細胞培養(yǎng)的條件上清液,進行HUVEC細胞的matrigal管腔形成實驗,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,瘦素預處理hMSCs組的條件上清液使HUVEC細胞管腔形成最明顯,進一步證實hMSCs的旁分泌效應。第二部分:在體外研究瘦素對間充質(zhì)干細胞的線粒體動力及功能的改變及其機制探索目的:線粒體是細胞凋亡中重要的細胞器,通過分析線粒體結(jié)構(gòu)和動力的相關(guān)調(diào)控因子,進一步探索瘦素對hMSCs的線粒體改變的機制方法與結(jié)果:在預處理瘦素(50ng/ml)24小時后,再將hMSCs進行GSDH誘導凋亡24小時。通過細胞透射電鏡觀察hMSCs的超微結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)瘦素預處理hMSCs中的線粒體明顯增粗增長、脊膨脹;而對照組的線粒體形態(tài)則是稀疏、短小的點狀樣。但是細胞氧耗量的檢測發(fā)現(xiàn)瘦素預處理組的hMSCs比對照組明顯減少,提示我們在凋亡模型中瘦素只對線粒體形態(tài)的完整性有保護作用,而對改善線粒體的氧化磷酸化功能沒有作用。進一步分析線粒體動力相關(guān)因子,發(fā)現(xiàn)在瘦素預處理hMCSs組中,線粒體上調(diào)控內(nèi)膜融合與分裂的因子Optic atrophy 1(OPA1)的蛋白水平明顯上調(diào),但在基因水平無變化。OPA1是與動力相關(guān)GTP酶樣蛋白,位于線粒體內(nèi)膜上,調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)膜的融合與分裂、維持脊結(jié)構(gòu)。OPA1有至少5個亞型,主要為長亞型(a、b)和短亞型(c、d、e)。有趣的是,長亞型OPA1(L-OPA1)和短亞型OPA1(S-OPA1)的功能截然相反,L-OPA1調(diào)控線粒體內(nèi)膜融合,S-OPA1控制線粒體內(nèi)膜分裂。我們發(fā)現(xiàn),在瘦素預處理組的hMSCs中的L-OPA1明顯增多,這符合電鏡下觀察到的線粒體增粗延長,提示線粒體的病理性融合。通過siRNA進行細胞OPA1的特異性基因沉默方式,證實瘦素對hMSCs的抗凋亡保護作用依賴于OPA1因子。進一步分析調(diào)控OPA1的因子后發(fā)現(xiàn),在瘦素預處理hMSCs組,另一個線粒體內(nèi)膜蛋白OMA1的降解增多。已有文獻報道,OMA1對OPA1有負性調(diào)節(jié)作用,OMA1的降解增加符合上述觀察到的OPA1的蛋白水平表達增多。同時,我們發(fā)現(xiàn)瘦素通過GSK3磷酸化激活而啟動OMA1的泛素化降解途徑,并且給予GSK3的抑制劑(SB216763)阻止了 OMA1的降解作用,提示OMA1的泛素化降解依賴于GSK3磷酸化激活。結(jié)論:在急性心肌梗死后的惡劣的微環(huán)境中,1)瘦素能夠通過維持線粒體脊結(jié)構(gòu)的完整性而增強hMSCs的抗凋亡能力;2)瘦素通過依賴于GSK3磷酸化的方式而介導OMA1的泛素化降解,從而減少OMA1對OPA1的剪切而使OPA1的蛋白表達水平增多,促使線粒體融合。我們提出了,瘦素通過作用于GSK3/OMA1/OPA1信號通路而增強hMSCs應激時的抗凋亡能力,為心血管疾病的干細胞治療提供新的靶點。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R542.22
【圖文】：

表達確定逡逑首先，我們對體外培養(yǎng)的ｈＭＳＣｓ進行形態(tài)學觀察，發(fā)現(xiàn)細胞大部分為紡錘形，逡逑呈全貼壁狀，細胞核呈圓形位于細胞中心（圖１Ａ）。進行流式細胞學鑒定，分析逡逑細胞的表面特異性陽性抗體和陰性抗體（圖１Ｂ），確定了邋ｈＭＳＣｓ的細胞特性。通逡逑過提取正常培養(yǎng)ｈＭＳＣｓ的細胞總蛋白，進行Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測明確ｈＭＳＣｓ有瘦素逡逑受體表達（圖２）。逡逑：逡逑：ｉｒｎ邋：ｆｆｎ邋：ｒｆｎ逡逑Ｈ邋Ｉ邋１邋；邐１邋ｄ邋‘逡逑ｔｔ＊邐＊＊■＊■逡逑圖１邋ｈＭＳＣｓ的細胞形態(tài)及表面特異性標記物鑒定６Ｕ相差光學顯逡逑微鏡下第４－８代ｈＭＳＣｓ生長至９０％融合度時的形態(tài)。６５」流式細胞鑒逡逑定，橫坐標為熒光強度，縱坐標為細胞數(shù)量。逡逑ＯｂＲ逡逑ｐ－ａｃｔｉｎ邋ｒｎｍｍｍ邐４３逡逑ｋＤａ逡逑圖２在ｈＭＳＣｓ中有瘦素受體表徸通過Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ檢測ｈＭＳＣｓ中有逡逑瘦素受體表徸。逡逑１９逡逑

細胞的表面特異性陽性抗體和陰性抗體（圖１Ｂ），確定了邋ｈＭＳＣｓ的細胞特性。通逡逑過提取正常培養(yǎng)ｈＭＳＣｓ的細胞總蛋白，進行Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測明確ｈＭＳＣｓ有瘦素逡逑受體表達（圖２）。逡逑：逡逑：ｉｒｎ邋：ｆｆｎ邋：ｒｆｎ逡逑Ｈ邋Ｉ邋１邋；邐１邋ｄ邋‘逡逑ｔｔ＊邐＊＊■＊■逡逑圖１邋ｈＭＳＣｓ的細胞形態(tài)及表面特異性標記物鑒定６Ｕ相差光學顯逡逑微鏡下第４－８代ｈＭＳＣｓ生長至９０％融合度時的形態(tài)。６５」流式細胞鑒逡逑定，橫坐標為熒光強度，縱坐標為細胞數(shù)量。逡逑ＯｂＲ逡逑ｐ－ａｃｔｉｎ邋ｒｎｍｍｍ邐４３逡逑ｋＤａ逡逑圖２在ｈＭＳＣｓ中有瘦素受體表徸通過Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ檢測ｈＭＳＣｓ中有逡逑瘦素受體表徸。逡逑１９逡逑

光報告基團，慢病毒過表達瘦素基因感染ｈＭＳＣｓ４８小時后，在倒置熒光顯微鏡下逡逑觀察，在瘦素過表徸基因組與質(zhì)�？蛰d組的ＧＦＰ熒光強度相似，感染效率均達９０％逡逑以上（圖３Ａ）。然后提取細胞總蛋白，通過Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ檢測證實，與質(zhì)�？蛰d組逡逑相比，在過表達瘦素基因姐的瘦素蛋白水平明顯上調(diào)，并檢測到ｆｌａｇ標簽蛋白（圖逡逑３Ｂ）0逡逑Ａ逡逑＿＿＿＿＿＿＿邋ｈＭＳＣｖｅｃ邐邐邋ｈＭＳＣｉｅｐ逡逑W逡逑Ｂ逡逑ｈＭＳＣｖｅｃ邋ｈＭＳＣｉｅｐ逡逑Ｆｌａｇ＾邐１９逡逑丨ｅｐ邋？贈、霸

本文編號：2745557