【摘要】：第一部分重組人血小板生成素的生殖毒性研究背景在臨床出血性疾病中,原發(fā)免疫性血小板減少癥(ITP)是最常見的。ITP在人群中發(fā)病率為5～10/10萬。女性發(fā)病率在育齡期高于同齡男性。在妊娠早期引起血小板減少的主要原因就是。其占妊娠期血小板減少總數(shù)的3%～5%。妊娠ITP患者的血小板計數(shù)多隨孕周增加進行性下降,至妊娠晚期達低谷。其中1 5%～3 5%的患者需要治療。妊娠合并ITP患者治療方案與非妊娠相似。一線治療推薦糖皮質激素或靜脈輸注丙種球蛋白。但對于一線治療無效的患者,二線治療非常有限,國內外指南推薦的唯一二線方案是激素聯(lián)合丙種球蛋白。最近一項重組人血小板生成素(rhTPO)用于妊娠合并ITP患者的臨床試驗初步證明,rhTPO可以明顯升高血小板計數(shù),且對孕產婦及胎兒/新生兒無明顯毒副作用。rhTPO廣泛用于妊娠合并ITP的臨床治療,仍需要系統(tǒng)嚴謹?shù)膭游锷扯拘詫嶒�。其藥物安全性仍需通過動物模型研究以得到可靠的證實。因此我們進行了rhTPO的生殖和發(fā)育毒性的相關研究。研究目的1.產仔雌性小鼠生殖毒性研究——生育能力及早期胚胎發(fā)育毒性試驗。2.產前發(fā)育毒性研究——胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗。3.圍產期毒性研究。研究方法1.生育能力的影響和胚胎早期發(fā)育毒性試驗。雌雄小鼠各80只合籠。雌性小鼠隨機分成四組:對照組和低中高劑量rhTPO組。自交配前14天至妊娠第5天(G5)每天定時皮下注射rhTPO。劑量為0 U/kg(對照組)、150 U/kg(低劑量組)、1500 U/kg(中劑量組)和15000U/kg(高劑量組)。主要觀察交配前14天至G18日常活動。記錄體重及進食量。G18處死孕鼠后大體解剖。主要記錄除子宮體重、黃體數(shù)、著床數(shù)、活胎數(shù)、吸收胎數(shù)及性別數(shù)等。著重觀察雌鼠受孕及流產狀況。計算各組生育指數(shù)、植入損失率及植入后損失率。解剖流產雌鼠,分析流產原因。2.胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗。成功交配的雌性小鼠80只隨機分成四組。G6至G15皮下給予不同劑量的rhTPO,記錄從G0-G18日常行為變化、體重及進食量。G18處死解剖孕鼠。記錄除子宮后體重及受孕胎產流產相關數(shù)量,計算相關比率。應用解剖顯微鏡檢查記錄胎仔外觀、內臟及骨骼的變異畸形。著重觀察是否有彎尾、腭裂、小胸腺、鼻腔擴張、側腦室增大、腎盂擴張、多生肋骨、顳骨不完全骨化、枕上穿孔等畸形。3.圍產期毒性研究。雌性小鼠和雄性小鼠各80只合籠,雌性小鼠隨機分成四組,從交配前14天至哺乳期第21天給予不同劑量rhTPO。全程觀察母鼠圍產期日常情況。觀察分娩狀況。記錄幼崽活產、死產和畸形數(shù)量,解剖死亡幼崽,分析死亡原因。觀察其生理狀態(tài)和行為發(fā)展,著重記錄幼崽發(fā)育進步的時間點,包括開眼、萌牙及相關神經發(fā)育反射(平面翻正反射、負趨地性、懸崖回避、視覺定位和聽覺驚跳反射等)。研究結果1.產仔雌性小鼠生殖毒性的研究。本階段所有實驗組均未見F0雌性小鼠日常異�，F(xiàn)象。有6只雌性小鼠分娩時因胎位不正難產死亡,其中對照組和中劑量組各1只,低劑量組和高劑量組各2只。尸檢后未發(fā)現(xiàn)與用藥有相關性。有4只小鼠未交配成功,其中對照組和低劑量組各1只,高劑量組2只。對其進行卡方檢驗,對照組和各劑量組之間無顯著性差異(P0.05)。隨著受孕、著床及妊娠后小鼠的生理變化,各組雌性小鼠增重相當(表1.A)。在G18尸檢雌性小鼠,記錄除子宮后體重、黃體數(shù)、植入數(shù)、活胎數(shù)、死胎數(shù)、早期流產數(shù)、晚期流產數(shù)、胎鼠雌雄數(shù)及胎鼠體重,進行統(tǒng)計分析,計算植入損失率、植入后損失率及性別比例,計算平均數(shù)±標準差,采用單因素方差分析檢驗(one-way ANOVA test),聯(lián)合 Tukey 多重比較檢驗(Tukey's multiple comparisons test)結果顯示各劑量組與對照組無顯著性差異(P0.05)(表1.B)。2.產前發(fā)育生殖毒性研究。F0代雌性小鼠符合妊娠期生理變化。分娩時,由于胎位不正2只小鼠難產死亡,對照組和低劑量組各1只,小鼠進食量和增重各組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)(表2.A)。在G18處死孕鼠,對其尸檢,所實驗小鼠均交配受孕成功,交配指數(shù)100%。記錄除子宮后體重、黃體數(shù)、植入數(shù)、活胎數(shù)、死胎數(shù)、早期流產數(shù)、晚期流產數(shù)及雌雄數(shù),計算平均數(shù)±標準差后,統(tǒng)計學分析示各記錄項目在四組間無顯著性差異(P0.05)。計算植入損失率、植入后損失率及性別比,各組間亦無顯著性差異(P0.05)(表2.B)。對胎鼠進行畸形學檢測,采用Kruskal-Wallis檢驗(Kruskal-Wallis test)聯(lián)合Dunn多重比較檢驗(Dunn's multiple comparisons test),對照組與各劑量組之間在活胎數(shù)量及胎鼠體重比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。對外觀、內臟和骨骼的畸形變異的觀察顯示:中劑量組出現(xiàn)1只小胸腺畸形,發(fā)生率在胎鼠生長發(fā)育畸形的正常范圍(P0.05)。4只胎鼠出現(xiàn)多生肋骨,其中對照組1窩2只,中高劑量組各有1只,1只低劑量組發(fā)生顳骨不完全骨化,上述畸形的發(fā)生率,在胚胎正常發(fā)育范圍內,與用藥無關,對照組與各劑量組比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。未觀察到其他系統(tǒng)的畸形變異(表2.C)。3.圍產期生殖毒性研究。在本階段研究中,仍存在因胎位不正難產死亡的孕鼠,對照組與中劑量組各1只,經卡方檢驗,分析與用藥無關,是分娩的正常不良現(xiàn)象。比較各組產仔雌鼠和幼崽的體重亦無顯著性差異(P0.05)(表3.A)。對子代小鼠的觀察研究中發(fā)現(xiàn),各組幼崽死產數(shù)相當,無顯著性差異(P0.05)。在哺乳期階段,各組幼崽都有死亡現(xiàn)象,計算存活指數(shù),各劑量組與對照組比例相當,無顯著性差異(P0.05)。存活幼崽在哺乳期增重正常,仔細觀察重點發(fā)育現(xiàn)象出現(xiàn)的時間點,各組間無顯著性差異(P0.05)(表3.B)。結論綜上所述,三種不同藥物劑量組的小鼠在交配、受孕、胚胎著床、胚胎發(fā)育、分娩、哺乳等各階段的大體外觀、尸檢后觀察臟器、胚胎、胎仔發(fā)育及子代成長的各項指標的觀察研究中,與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。在本研究條件下,rhTPO對小鼠的雌性生殖力及胚胎發(fā)育、分娩、哺乳的無不良反應劑量(NOAEL)為 15000U/kg/day。意義rhTPO用于雌性小鼠的生殖功能無不良反應,為臨床上用于妊娠合并ITP患者的治療提供實驗依據(jù)支持。第二部分rhTPO對妊娠合并ITP模型小鼠Tregs的影響及相關機制研究背景促血小板生成素(TPO)是一種內源性蛋白激酶,通過結合巨核細胞膜上的c-Mp1受體,進而激活巨核細胞上的JAK/STAT、Ras/MAPK等信號通路,來誘導酪氨酸磷酸化,從而刺激巨核祖細胞增殖、分化、成熟。TPO在巨核細胞生成的各個階段調節(jié)血小板的生成,增加血小板的數(shù)量,緩解由于各種原因所致的血小板減少。重組人血小板生成素(rhTPO)已在臨床廣泛應用于ITP二線治療及化療相關的血小板減少的治療。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)rhTPO治療ITP妊娠小鼠模型有效,對小鼠妊娠及圍產期無明顯不良作用。進一步檢測rhTPO治療前后調節(jié)性T淋巴細胞(Tregs)的比例及轉化生長因子-β(TGF-β)的水平,證明rhTPO可以有效提升TGF-β水平,提高Tregs比例。但對于rhTPO與Tregs和TGF-β的作用關系尚不清楚,本研究著重探究rhTPO的作用機制與Tregs和TGF-β的關系,以進一步探索rhTPO用于治療ITP的免疫調節(jié)機制。研究目的1.妊娠合并ITP小鼠模型的建立,檢測其穩(wěn)定性。流式細胞術檢測脾臟單細胞懸液全淋巴細胞中CD4+T細胞與TPO配體c-Mβ1的表達。研究T細胞表面是否存在的TPO的結合位點,即rhTPO是否可直接作用于T淋巴細胞。2.進一步驗證TPO免疫調節(jié)中Tregs和TGF-β的關系。應用流式細胞術檢測妊娠ITP小鼠脾臟單細胞懸液CD4+T細胞中Tregs的比例,口服TGF-β受體抑制劑(LY2109761)后皮下注射rhTPO治療后Tregs 比例變化,探究Tregs和TGF-β的作用關系。3.建立條件敲除血小板表面TGF-β的基因ITP小鼠模型,檢測rhTPO對外周血小板計數(shù)、Tregs比例及TGF-β水平的影響,探究rhTPO對Tregs的作用機制。研究方法1.被動妊娠合并ITP小鼠穩(wěn)定模型建立。根據(jù)本課題前期試驗的相關研究經驗和方法,雌雄比2:1合籠至確認妊娠,尾靜脈注射抗CD41抗體(MWReg30)5μg/200μL/只,確認妊娠合并ITP模型鼠成功建立。四組劑量rhTPO治療模型鼠后,檢測外周血小板計數(shù)證明rhTPO治療效果。2.血小板(PF4-Cre)特異性TGF-β敲除小鼠的繁育,以建立被動性條件性TGF-β基因敲除ITP小鼠模型。建模前后小鼠外周血小板計數(shù)檢測比較,確定建模情況。3.妊娠合并ITP模型小鼠在妊娠結束留取外周血后處死,解剖出脾臟,網篩研磨法提取脾臟單細胞懸液。利用流式細胞術檢測脾臟CD4+T細胞與TPO配體c-Mpl的表達。4.CD4+免疫磁珠法分選出妊娠合并ITP模型小鼠脾臟CD4+T細胞,用0μg/L和2μg/L的rhTPO培養(yǎng)3天,應用流式細胞術檢測體外rhTPO治療后,脾臟CD4+T細胞中Tregs的比例差異。5.妊娠合并ITP小鼠模型20只,隨機分成兩組。實驗組口服100mg/kg TGF-β受體抑制劑(LY2109761),對照組口服相同體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液,共14天。從第1天開始,同時給兩組小鼠皮下注射1500U/kg rhTPO 14天后,處死所有模型小鼠。檢測血小板計數(shù)。6.流式細胞術檢測上一步rhTPO治療妊娠合并ITP小鼠模型脾臟CD4+T細胞中Tregs比例。7.被動條件性TGF-β基因敲除ITP小鼠模型皮下注射rhTPO 15000U/Kg/day,治療14天后處死小鼠,留鼠尾血,制備脾臟單細胞懸液。檢測外周血小板計數(shù)。Elisa法檢測血清中TGF-β1水平。流式細胞術檢測單細胞懸液中Tregs比例。研究結果1.成功建立妊娠合并ITP模型小鼠。2.四組劑量rhTPO治療ITP孕鼠后,低中高劑量組血小板計數(shù)明顯高于對照組。3.建立被動條件性TGF-β基因敲除ITP小鼠模型成功。被動條件性TGF-β基因敲除ITP模型組和flox ITP對照組外周血小板計數(shù)在注射抗體24h后均明顯下降。直至第14天,血小板計數(shù)仍均低于建模前。兩組間對比無顯著性差異。4.TGF-β基因敲除模型鼠rhTPO治療組血漿TGF-β1水平明顯低于未行基因敲除ITP模型rhTPO治療組(P=0.040)。5.流式細胞術結果分析顯示,ITP孕鼠脾臟單細胞懸液全淋巴細胞中CD4+T細胞與c-Mpl無共表達,提示全淋巴細胞中CD4+T細胞表面c-Mpl呈陰性。rhTPO不能直接作用于CD4+T細胞。6.體外試驗,rhTPO培養(yǎng)ITP孕鼠脾臟淋巴細胞組與對照組,CD4+/CD25hi/Foxp3+Tregs細胞占CD4+T細胞比例無顯著性差異(P=0.619)。7.rhTPO升高血小板計數(shù)不需要TGF-β參與7.1妊娠合并ITP模型鼠rhTPO治療過程中,加用TGF-β受體抑制劑與單純rhTPO治療對照組小鼠外周血血小板計數(shù)。兩組間對比無顯著性差異(P=0.347)。7.2 TGF-β基因敲除ITP模型鼠rhTPO治療組與未行基因敲除ITP模型rhTPO治療組血小板計數(shù)均有回升,且無顯著性差異(P=0.685)。8.Tregs 比例升高與TGF-β水平升高有關8.1妊娠合并ITP模型鼠rhTPO治療過程中,口服TGF-β受體抑制劑小鼠脾臟CD4+T細胞中Tregs 比例明顯低于單純rhTPO治療ITP孕鼠模型組(P=0.044)。8.2 TGF-β基因敲除ITP模型鼠rhTPO治療組脾臟CD4+T細胞Tregs 比例與未行基因敲除ITP模型rhTPO治療組相比明顯減低(P=0.040)。結論通過對ITP發(fā)病機制研究發(fā)現(xiàn),由抗血小板抗體介導的ITP的發(fā)病過程,在一定程度上能夠被妊娠ITP小鼠模型所重復。rhTPO被推薦為原發(fā)免疫性血小板減少癥治療的二線藥物,不能直接作用于CD4+T細胞,而是通過c-Mpl作用于巨核細胞表面,刺激巨核細胞活化產生血小板,血小板釋放TGF-β1增加,進而提高Tregs在CD4+T細胞中比例,發(fā)揮調節(jié)免疫作用。意義重組人血小板生成素用于治療妊娠合并ITP小鼠模型升血小板計數(shù)療效確切。rhTPO主要通過與巨核細胞表面受體c-Mpl結合,促進巨核細胞活化增生,提高血小板計數(shù),增升的血小板促進釋放TGF-β1,進一步提高Tregs在T細胞中比例,促進ITP患者長期緩解誘導免疫耐受提供有效理論依據(jù)。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R558.2
【圖文】：

ｄａｙｓ逡逑妊娠合并丨ＴＰ小鼠（ＩＴＰ邋ｇｒｏｕｐ）與妊娠野生小鼠（ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ）逡逑血小板計數(shù)比較逡逑７ＢＬ／６Ｊ背景雌雄小鼠合籠后，確認妊娠成功后起每隔１天定時尾靜Ｒｅｇ３０邋（ＩＴＰ邋ｇｒｏｕｐ）或等量生理鹽水（ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ），注射后２４ｈ血小板計數(shù)。ＩＴＰ邋ｇｒｏｕｐ在第１天血小板計數(shù)急劇下降到最低水平，都保持在相對穩(wěn)定的低水平。在第１４天，妊娠合并ＩＴＰ模型組的血低于未造模對比組妊娠小鼠。所有數(shù)據(jù)按照觀察時間點及分組，均以準差表示，兩組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，通過方差齊性檢驗后，進行兩組驗，ｎ＝１０，兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義（Ｐ＜０．０５）。逡逑

圖２不同劑置ｒｈＴＰＯ治療妊娠合并Ｉ邋ＴＰ小鼠后血小板變化逡逑合并ＩＴＰ小鼠隨機分成四組，按實驗設計方案，給予相應劑量ｒｈ邋0Ｕ／ｋｇ／ｄ邋（對照組邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ）、１５０Ｕ／ｋｇ／ｄ邋（低劑量組邋ｌｏｗ－ｄｏｓｅ）ｇ／ｄ邋（中劑量組邋ｍｉｄ－ｄｏｓｅ）和邋１５０００邋Ｕ／ｋｇ／ｄ邋（高劑量組邋ｈｉｇｈ－ｄｏｓｅ），對生理鹽水。不同劑量ｒｈＴＰＯ組小鼠血小板計數(shù)較對照組明顯升高。加，血小板升高作用增強，在第７、１０、１４天，ｒｈＴＰＯ治療組血小高于對照組。所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)土標準差表示，采用單因素方差Ａ）檢驗，然后采用Ｄｕｎｎ多重比較檢驗，ｎ＝１０。其中第２１天高劑ｓｅ）與對照組（ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ）比較有顯著性差異（Ｐ＜０．０５）。逡逑

ｄａｙｓ逡逑圖３被動條件性ＴＧＦ－Ｐ基因敲除ＩＴＰ小鼠模型組逡逑和ｆｌｏｘ邋ＩＴＰ對照組建模后血小板計數(shù)比較逡逑將條件性ＴＧＦ－Ｐ基因敲除小鼠１０只設定為模型組小鼠（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ邋ｇｒｏｊｕ－Ｍａｐ３ｋ７ｅｍｌＣｆｌｏｘ／Ｇｐｔ條件性基因敲除ｆｌｏｘ小鼠１０只設定為對照ｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ）。兩組小鼠腹腔注射Ｒａｔ邋ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ邋ＣＤ４１Ａｂ共１４天，００吣／只，每４８ｈ重復注射。在建模前、第１天、第４天、第７天、１４天采集尾靜脈外周血，檢測血小板計數(shù)，觀察到兩組小鼠在注射血小板計數(shù)均明顯下降，第１天血小板計數(shù)達最低，至第１４天，兩板計數(shù)均低于建模之前，證明ＩＴＰ模型建立成功。所有數(shù)據(jù)按照觀察組，均以平均數(shù)土標準差表示，兩組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，通過方差齊，進行兩組獨立樣本ｔ檢驗，ｎ＝１０，兩組間比較無顯著性差異（尸＞邋０．０

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