【摘要】：目的MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中具有調(diào)控功能的非編碼RNA,目前對(duì)miRNAs在心肌損傷中的作用的研究很少。本課題主要探究了miR-762在心肌損傷中的作用。方法我們將小鼠原代心肌分為空白對(duì)照組和缺氧/復(fù)氧(A/R)處理的實(shí)驗(yàn)組,用高通量microRNAs基因芯片對(duì)收取的兩組樣品中的miRNA的表達(dá)譜進(jìn)行差異性篩選。用qPCR對(duì)篩選出的miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證,并篩選出miR-762這個(gè)基因。采用缺氧/復(fù)氧(A/R)的處理對(duì)小鼠原代心肌細(xì)胞造成損傷后,使用qPCR檢測(cè)miR-762在胞液和線粒體中的表達(dá)情況,并用熒光原位雜交技術(shù)和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)對(duì)其做出定位。設(shè)計(jì)與miR-762互補(bǔ)的化學(xué)修飾的antagomir以抑制內(nèi)源miR-762和antagomir陰性對(duì)照(anta-NC)的表達(dá),并經(jīng)過(guò)A/R處理使心肌細(xì)胞受損,我們將其分為四組(對(duì)照,A/R,A/R+anta-NC,A/R+anta-762)。然后通過(guò)ATP含量、活性氧(ROS)水平、線粒體復(fù)合物活性和細(xì)胞凋亡等指標(biāo)來(lái)檢測(cè)心肌細(xì)胞受損時(shí)抑制miR-762的表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞和線粒體造成的影響。我們按照實(shí)驗(yàn)需要對(duì)小鼠進(jìn)行了四組處理,antagomir以抑制內(nèi)源miR-762和陰性對(duì)照(anta-NC)的表達(dá),并采用心臟缺血再灌(ischemia/reperfusion,I/R)的方式建立小鼠心梗模型(Sham,I/R,I/R+anta-NC,I/R+anta-762)。然后收取正常的心臟組織和經(jīng)I/R處理后的心臟組織,用qPCR檢測(cè)miR-762在小鼠心梗后的表達(dá)情況,同時(shí)檢測(cè)了線粒體復(fù)合物活性,細(xì)胞凋亡情況,心梗面積及心臟功能。結(jié)果(1)對(duì)miRNA基因芯片的結(jié)果進(jìn)行分析并用qPCR驗(yàn)證后,我們發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比A/R處理后miR-762在線粒體中的表達(dá)明顯升高。(2)miR-762主要定位于細(xì)胞質(zhì)的線粒體中。(3)A/R處理會(huì)使原代心肌細(xì)胞受損并刺激miR-762的表達(dá),而antagomir miR-762(anta-762)可以有效地抑制由心肌損傷引起的miR-762的表達(dá)。抑制miR-762的表達(dá)可以顯著地抑制由A/R誘導(dǎo)的ATP的降低,抑制由A/R誘導(dǎo)的活性氧水平升高,抑制由A/R誘導(dǎo)的線粒體復(fù)合物活性的降低,并減少了心肌細(xì)胞的凋亡。(4)心臟缺血再灌(I/R)會(huì)使小鼠心臟受損甚至梗死,心梗區(qū)域的miR-762表達(dá)會(huì)升高。當(dāng)抑制了miR-762的表達(dá)并對(duì)小鼠心臟進(jìn)行I/R處理后,線粒體復(fù)合物I活性升高,細(xì)胞凋亡減少,心梗的面積減少,并且心臟功能恢復(fù)。結(jié)論我們通過(guò)A/R處理使小鼠原代心肌細(xì)胞受損,然后使用基因芯片篩選到了在受損的心肌細(xì)胞線粒體中高表達(dá)的miR-762這個(gè)分子。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)探究我們得出了以下的結(jié)論:(1)在受損的心肌細(xì)胞線粒體中miR-762的表達(dá)會(huì)顯著升高。(2)抑制miR-762的表達(dá)可以顯著地抑制由心梗導(dǎo)致的ATP的降低,活性氧水平升高,抑制心肌損傷造成的線粒體復(fù)合物活性的降低,并減少了心肌細(xì)胞的凋亡。(3)通過(guò)抑制miR-762的表達(dá)來(lái)恢復(fù)受損心臟中線粒體功能和心臟功能的新途徑。這為治療心梗等心臟疾病和線粒體相關(guān)疾病提供了一種新的治療策略。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R542.22
【圖文】：

1 MiRNA 芯片篩選結(jié)果圖。原代心肌細(xì)胞隨機(jī)分組為空白對(duì)照組和缺氧/復(fù)氧實(shí)驗(yàn)組，其中 miR-762 差異性最顯著，P<0.05。R-762 在線粒體中的表達(dá)情況我們提取了正常情況下小鼠原代心肌細(xì)胞的總 RNA 和線粒體 RNA，用 miR-762 的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)線粒體中 miR-762 的表達(dá)占總 RNA 的一半多（明 miR-762 主要在線粒體中富集。將小鼠原代心肌細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì) 處理組進(jìn)行培養(yǎng)后提取胞液和線粒體 RNA，同樣用 qPCR 檢測(cè) miR-76況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)A/ R處理后miR-762的水平是上調(diào)的，而且線粒體中m調(diào)十分明顯（圖 2B），這說(shuō)明 A/ R 處理會(huì)引起線粒體中 miR-762 的水平

圖 2 A. 小鼠原代心肌細(xì)胞的總 RNA 和線粒體 RNA，用 qPCR 檢測(cè) miR-762 的表達(dá)量。B.小鼠原代心肌細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組和 A/ R 處理組進(jìn)行培養(yǎng)后提取胞液和線粒體 RNA，用qPCR 檢測(cè) miR-762 的表達(dá)情況，P＜0.05，結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3 miR-762 在細(xì)胞中的定位將分離的原代心肌細(xì)胞鋪片培養(yǎng)，48h 后將玻片取出進(jìn)行熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)。用 0.02 μM MitoTracker 將線粒體染為紅色，用 LNATM microRNA 探針雙 DIG 標(biāo)記miR-762，通過(guò)用標(biāo)記的核酸（LNA）探針進(jìn)行熒光原位雜交來(lái)檢測(cè) miR-762，用DAPI 染細(xì)胞核，最后使用激光掃描共聚焦顯微鏡對(duì)熒光成像。我們發(fā)現(xiàn) miR-762主要定位于胞質(zhì)的線粒體中（圖 3A）。將收取的原代心肌細(xì)胞，使用 Ago2 特異性抗體進(jìn)行免疫共沉淀，并且用正常IgG 抗體作為陰性對(duì)照。免疫共沉淀最后收取的珠子，一半珠子用 100mM 甘氨酸洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)，另一半用 TRIzol 分離 RNA。MiR-762 從細(xì)胞核中輸出后會(huì)和 Ago2相結(jié)合，然后通過(guò)膜蛋白 Tom 進(jìn)入線粒體中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中有大量的 Ago2蛋白，且與陰性對(duì)照組相比Ago2組中miR-762表達(dá)水平特別高，這可以說(shuō)明miR-762

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本文編號(hào)：2741655