【摘要】：研究背景:動脈粥樣硬化是造成多種心血管疾病的最主要原因,是目前威脅全球人類健康的首要殺手。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。血管緊張素原(AGT)是RAS的唯一底物,主要來源于肝臟,它在腎素的酶切作用下形成血管緊張素 Ⅰ(AngⅠ)和無 AngⅠ合成功能的des(AngⅠ)AGT,血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)進(jìn)一步剪切AngⅠ生成血管緊張素Ⅱ(AngⅡ),后者是動脈粥樣硬化的重要促進(jìn)因子。然而,目前對于AGT合成AngⅡ并發(fā)揮促動脈粥樣硬化效應(yīng)的調(diào)控機(jī)制尚不明確。Megalin屬于低密度脂蛋白受體家族,主要在極化的上皮細(xì)胞中表達(dá)。既往的研究證實,megalin在腎臟的近端小管中與AGT存在相互作用。本課題旨在探索megalin是否參與調(diào)控AGT轉(zhuǎn)換為AngⅡ的過程及動脈粥樣硬化的形成。研究方法及結(jié)果:為了證實AGT促動脈粥樣硬化作用的AngⅡ依賴性,我們構(gòu)建了肝細(xì)胞特異性AGT敲除且低密度脂蛋白受體敲除(LDLR-/-)的雙基因敲除小鼠(簡稱hepAGT-/-)及其同窩表達(dá) AGT 的 LDLR-/-小鼠(簡稱 hepAGT+/+)。hepAGT+/+小鼠予注射空載腺相關(guān)病毒(AAV),hepAGT-/-分別注射空載AAV、攜帶野生型AGT或des(AngⅠ)AGT的AAV,通過高脂喂養(yǎng)12周誘導(dǎo)動脈粥樣硬化,發(fā)現(xiàn)hepAGT-/-小鼠的動脈粥樣硬化較hepAGT+/+顯著減輕,野生型AGT AAV顯著增加hepAGT-/-小鼠的動脈粥樣硬化面積,而des(AngⅠ)AGT AAV對hepAGT-/-小鼠的動脈粥樣硬化無明顯作用。為了探究AGT敲除對AngⅡ水平的影響,我們檢測了 hepAGT+/+與hepAGT-/-小鼠血漿和腎臟的AngⅡ含量,發(fā)現(xiàn)兩者血漿AngⅡ無顯著差異,而hepAGT-/-小鼠的腎臟AngⅡ含量較hepAGT+/+小鼠顯著降低。通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),在hepAGT+/+小鼠中,megalin、AGT、腎素及ACE共同定位于腎臟近端小管。反義寡核苷酸(ASO)抑制megalin的表達(dá)后,近端小管中的AGT和腎素消失,同時尿液中兩者的含量顯著升高。此外,抑制megalin后小鼠的腎臟AngⅡ含量顯著降低,而血漿AngⅡ濃度無改變。為了研究megalin是否參與動脈粥樣硬化的形成,我們予雄性和雌性LDLR-/-小鼠注射megalin ASO,并設(shè)立PBS和control ASO注射組作為對照,通過高脂喂養(yǎng)12周發(fā)現(xiàn),抑制megalin顯著減少了動脈粥樣硬化的形成。通過生物信息學(xué)分析,我們發(fā)現(xiàn)AGT分子遠(yuǎn)端存在高度保守序列。為了研究這些保守序列是否介導(dǎo)AGT與megalin結(jié)合,我們構(gòu)建了保守序列突變的AGT重組蛋白,在體外通過表面等離子共振技術(shù)發(fā)現(xiàn),AGT突變體與megalin的親和力減弱。為了探究AGT的保守序列是否影響動脈粥樣硬化形成,我們予hepAGT-/-小鼠注射攜帶突變AGT的AAV,并設(shè)立hepAGT+/+及hepAGT-/-小鼠注射空載AAV為對照,高脂喂養(yǎng)12周后發(fā)現(xiàn)注射AGT突變體后hepAGT-/-小鼠的動脈粥樣硬化面積與hepAGT+/+小鼠無差異。結(jié)論:本研究揭示了 megalin是腎臟內(nèi)RAS穩(wěn)態(tài)和動脈粥樣硬化形成的重要調(diào)控因子,提示megalin介導(dǎo)的腎臟AngⅡ生成在動脈粥樣硬化中起重要作用。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R54
【圖文】：

ｈｅｐＡＧＴ－／－小鼠的血漿ＡＧＴ水平低于其同窩ｈｅｐＡＧＴ＋／＋小鼠的１０％，逡逑而注射攜帶各ＡＧＴ重組體的ＡＡＶ后，ｈｅｐＡＧＴ－／－小鼠的血漿總ＡＧＴ濃度達(dá)到與逡逑ｈｅｐＡＧＴ＋／＋小鼠一致水平（圖１Ａ）。通過ｔａｉｌ－ｃｕｆｆ法測量小鼠尾動脈血壓發(fā)現(xiàn)，逡逑ｈｅｐＡＧＴ－Ｍ、鼠血壓顯著低于ｈｅｐＡＧＴ＋／＋小鼠，ＷＴ邋ＡＧＴ可升高ｈｅｐＡＧＴ－／－小鼠的逡逑血壓，而ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴ對血壓無影響（圖１Ｂ）。經(jīng)過１２周高脂飼料喂養(yǎng)后，我逡逑們發(fā)現(xiàn)予空載病毒注射的ｈｅｐＡＧＴ－／－小鼠的動脈粥樣硬化顯著減輕，ＷＴＡＧＴ逡逑ＡＡＶ注射后ｈｅｐＡＧＴ－／－小鼠動脈粥樣硬化斑塊面積大小與ｈｅｐＡＧＴ＋／＋小鼠相近，逡逑而ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴ注入ｈｅｐＡＧＴ－／－小鼠后并不發(fā)揮促動脈粥樣硬化作用（圖１Ｃ－逡逑Ｄ）。以上結(jié)果提示，肝源性ＡＧＴ是動脈粥樣硬化形成的關(guān)鍵因子，其促動脈粥逡逑樣硬化效應(yīng)主要依賴于Ａｎｇｌｌ，而非ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴ。逡逑２５逡逑

邐正文結(jié)果逡逑異（圖２Ａ），提示系統(tǒng)性的Ａｎｇｌｌ激活并非促進(jìn)動脈粥樣硬化病理形成的直接誘逡逑因。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑血漿邐腎臟逡逑２０００邋邐邋２０００邋邐逡逑１邋１５００邐＾邋１５00邐Ｔ邐Ｐ＝０００７逡逑ｃｎ邐ｃｎ逡逑■逡逑Ｃ邋１０００邐？邐１０００逡逑５００邋５0°＇逡逑＿＿0Ｌ＾Ｈ＿＿逡逑ｈｅｐＡＧＴ＋／＋邋ｈｅｐＡＧＴ－／－邐ｈｅｐＡＧＴ＋／＋邋ｈｅｐＡＧＴ－／－逡逑圖２邋ｈｅｐＡＧＴ＋／＋和ｈｅｐＡＧＴ－／－小鼠血漿及腎臟中Ａｎｇｌｌ的濃度。Ａ，小鼠血漿逡逑Ａｎｇｌｌ濃度；Ｂ，小鼠腎臟Ａｎｇｌｌ濃度；ｎ．ｓ．：無統(tǒng)計學(xué)差異。逡逑我們的既往研究排除了在巨噬細(xì)胞及血管壁成分細(xì)胞中Ａｎｇｌｌ的局部產(chǎn)生或逡逑激活對動脈粥樣硬化的影響［３６－３９］，因此目前對于動脈粥樣硬化中Ａｎｇｌｌ產(chǎn)生位逡逑點和作用靶點仍不明確。腎臟是ＲＡＳ合成并發(fā)揮病理生理學(xué)功能的重要器官，其逡逑自身的Ａｎｇｌｌ合成量遠(yuǎn)高于血液循環(huán)中Ａｎｇｌｌ的濃度［２２－２４］。因此我們進(jìn)一步檢逡逑測了腎臟的Ａｎｇｌｌ水平，發(fā)現(xiàn)ｈｅｐＡＧＴ＋／＋小鼠的腎臟Ａｎｇｌｌ含量高達(dá)其血漿濃度逡逑的近１０倍；同時，在敲除肝臟ＡＧＴ后，腎臟Ａｎｇｌ丨的生成量顯著下降（圖逡逑２Ｂ）。以上結(jié)果提示，ｈｅｐＡＧＴ－／－小鼠動脈粥樣硬化的減輕與其腎臟Ａｎｇｌｌ含量逡逑下降相關(guān)

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