【摘要】：第一部分:TWS119促進(jìn)ITP巨核細(xì)胞凋亡和血小板生成的作用研究研究背景:免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia,ITP)是一種臨床比較常見的獲得性出血性疾病,以血小板減少為主要特點(diǎn),自身免疫紊亂是其發(fā)病的始動因素。輕者可無明顯出血癥狀,嚴(yán)重者可出現(xiàn)皮膚黏膜出血、月經(jīng)過多、甚至內(nèi)臟及顱內(nèi)出血,危及生命。血小板破壞增多和/或血小板生成減少是ITP的突出特點(diǎn)。目前研究普遍認(rèn)為,血小板生成與巨核細(xì)胞的生理性凋亡關(guān)系密切,巨核細(xì)胞通過啟動局部Caspase依賴的細(xì)胞凋亡程序進(jìn)而調(diào)控血小板前體的形成。研究表明,抑制Caspase的活性能明顯降低巨核細(xì)胞成熟和功能性血小板的生成及釋放。而且高分辨率投射電子顯微鏡對巨核細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果顯示在血小板前體突起形成的早期階段,巨核細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上就已發(fā)生了異染色質(zhì)濃集等早期凋亡的變化。Ucar等研究指出慢性ITP患者的骨髓巨核細(xì)胞的凋亡率較急性ITP患者明顯降低。另有研究報道發(fā)現(xiàn)ITP患者的成熟巨核細(xì)胞中有75%以上呈現(xiàn)出副凋亡(paraptosis)的形態(tài)學(xué)特點(diǎn),應(yīng)用激素后改善;然而,將患者血漿加入體外培養(yǎng)的巨核細(xì)胞,同樣觀察到副凋亡的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。由此推測,巨核細(xì)胞的凋亡受到抑制或者不能發(fā)生正常形式的生理性凋亡,同樣會影響血小板的生成。糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3,GSK-3)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,其功能具有多樣性。最早研究發(fā)現(xiàn)GSK-3可促進(jìn)糖原合成酶磷酸化從而抑制糖原合成,是參與糖代謝的主要限速酶之一。近年來研究表明,GSK-3還同時參與許多其他的細(xì)胞內(nèi)的重要生理過程,如細(xì)胞分化、增殖和凋亡等。GSK-3β抑制劑TWS119是一類4,6-二取代吡咯并嘧啶,體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),TWS119能夠增強(qiáng)骨髓細(xì)胞中巨核細(xì)胞的生成和血小板的釋放。最新研究發(fā)現(xiàn),GSK-3β抑制劑可能是通過促進(jìn)巨核細(xì)胞生成和成熟,從而能夠有效的促進(jìn)血小板釋放。在本研究中,我們觀察到在低劑量的TWS119作用下,加入ITP患者血漿的體外培養(yǎng)體系中巨核細(xì)胞和血小板生成以及巨核細(xì)胞凋亡比例顯著增加。我們還進(jìn)一步研究了ITP小鼠模型中TWS119對巨核細(xì)胞和血小板生成的影響,結(jié)果顯示TWS119對巨核細(xì)胞凋亡和血小板釋放具有明顯的促進(jìn)作用,提示其對ITP的潛在治療作用。目的:通過觀察低劑量TWS119對ITP患者血漿作用下巨核細(xì)胞的成熟、凋亡障礙和血小板生成不足的影響,探討其用于促進(jìn)ITP患者血小板生成的可能性和作用機(jī)制。方法:(1)ITP患者和健康對照:收集62例ITP患者和23例健康對照的外周血,分離制備血漿。(2)采集足月妊娠臍血80-100 mL,分離臍血來源的CD34+細(xì)胞,在1 mL無血清培養(yǎng)基(serum-free expansion medium,SFEM)中加入重組人血小板生成素(recombinant human thrombopoietin,rhTPO),重組人IL-3(recombinant human interleukin,rhIL-3)和干細(xì)胞因子(stem cell factor,SCF)共培養(yǎng),于第4天加入不同濃度(0-100 μM)的GSK-3β抑制劑TWS119繼續(xù)培養(yǎng),在培養(yǎng)的第14天通過流式細(xì)胞術(shù)檢測培養(yǎng)體系中巨核細(xì)胞生成數(shù)量和凋亡率、血小板釋放數(shù)量及多倍體巨核細(xì)胞比例等,確定TWS119的最佳作用劑量。(3)于上述培養(yǎng)體系中分別加入100μITP患者或者健康對照的血漿,第4天加入最佳作用劑量的TWS119繼續(xù)培養(yǎng),在培養(yǎng)的第14天進(jìn)行檢測,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測培養(yǎng)體系中生成的巨核細(xì)胞數(shù)量和其釋放的血小板數(shù)量及巨核細(xì)胞凋亡比例及多倍體巨核細(xì)胞的比例。(4)實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)檢測巨核細(xì)胞凋亡相關(guān)分子TRAIL、TRAIL-R2、Bcl-2、Bcl-xL、TNF-α Fas、Fas-L mRNA的表達(dá)量。(5)流式細(xì)胞術(shù)檢測TRAIL、TRAIL-R2、Bcl-2、Bcl-xL、TNF-α、Fas、Fas-L、活化Caspase-3、活化Caspase-8的表達(dá)量。Western blot檢測TRAIL、Caspase-3、Caspase-8的表達(dá)量。(6)動物實(shí)驗(yàn):將野生型C57BL/6小鼠血小板輸入同種CD61基因敲除小鼠體內(nèi),然后將后者的脾臟細(xì)胞輸給聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immuoderficient,SCID)小鼠,導(dǎo)致SCID小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的血小板減少,構(gòu)建主動型ITP小鼠模型。(7)將SCID小鼠分為4組,a組僅接受射線輻照,無任何細(xì)胞轉(zhuǎn)輸;b組接受射線輻照,并于輻照當(dāng)日開始腹腔注射lmg/kg TWS119,之后隔天注射1次,注射兩周;c組接受腹腔注射野生型小鼠血小板免疫的CD61基因敲除小鼠脾細(xì)胞和射線輻照;d組接受同等劑量脾細(xì)胞、TWS119治療以及射線輻照。每周進(jìn)行血小板采集監(jiān)測血小板計(jì)數(shù)并進(jìn)行結(jié)果分析。借助體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評估TWS119治療對主動型1TP小鼠模型的治療效應(yīng)。結(jié)果:(1)TWS119在體外能夠促進(jìn)巨核細(xì)胞成熟和血小板生成,并呈劑量依賴性。在體外培養(yǎng)體系中加入不同濃度的TWS119(0-100 μM),培養(yǎng)后進(jìn)行檢測。TWS119在體外可以促進(jìn)巨核細(xì)胞生成、成熟和血小板釋放,并且TWS119對巨核細(xì)胞的作用呈劑量依賴性。其最佳作用濃度是1 μM,在該濃度下體外培養(yǎng)體系中巨核細(xì)胞和血小板生成數(shù)量、多倍體(≥ 4N)巨核細(xì)胞的比例最高。當(dāng)TWS119的濃度大于10 μM時抑制巨核細(xì)胞和血小板的產(chǎn)生,當(dāng)濃度大于100 μM時,TWS119對巨核細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞毒性,其現(xiàn)象為巨核細(xì)胞凋亡比例明顯升高,但生成數(shù)量和多倍體巨核細(xì)胞比例下降,血小板釋放減少,即巨核細(xì)胞發(fā)生了未成熟的無效凋亡。(2)ITP患者血漿對巨核細(xì)胞產(chǎn)生、成熟、凋亡和血小板釋放有不同影響。將23例健康對照組血漿孵育體系中生成的巨核細(xì)胞數(shù)量(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,5.35±0.79 ×105)定義為正常范圍。由此,根據(jù)62例ITP患者血漿孵育體系中生成的巨核細(xì)胞數(shù)量分為三組,ITP患者血漿孵育下的巨核細(xì)胞生成數(shù)量比正常范圍的健康對照組升高,且高于正常范圍上限的,定義為A組(33例);ITP患者血漿孵育下的巨核細(xì)胞生成數(shù)量比正常范圍的健康對照組低,且低于正常范圍下限的,定義為B組(18例);ITP患者血漿孵育下的巨核生成細(xì)胞數(shù)量與健康對照組無明顯差異,處于正常范圍內(nèi)的,定義為C組(11例)。同時,A組和B組的血小板釋放水平與健康對照組相比顯著降低,C組與健康對照組之間沒有顯著差異。A組的巨核細(xì)胞凋亡率低于健康對照組,B組和C組與健康對照組之間未觀察到顯著差異。(3)TWS119對正常對照和部分ITP血漿培養(yǎng)巨核細(xì)胞成熟和血小板釋放有促進(jìn)作用。在A組培養(yǎng)體系中加入TWS119后,其巨核細(xì)胞生成數(shù)量,血小板數(shù)量,巨核細(xì)胞凋亡比例和多倍體比例(≥ 4N)顯著升高。健康對照組加入TWS119也觀察到巨核細(xì)胞生成數(shù)量,血小板數(shù)量,巨核細(xì)胞凋亡比例和多倍體比例(≥ 4N)顯著升高。然而,B組和C組加入TWS119前后并沒有觀察到明顯變化。(4)TWS119抑制巨核細(xì)胞Bcl-xL和Bcl-2表達(dá),并且增加TRAIL表達(dá)。流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示Bcl-xL和Bcl-2在A組巨核細(xì)胞的表達(dá)量顯著高于健康對照組的表達(dá);加入1μM TWS119處理后,A組Bcl-xL、Bcl-2表達(dá)顯著下降;并且A組TRAIL、活化Caspase-3和活化Caspase-8的表達(dá)明顯低于對照組;當(dāng)加入TWS119處理后,A組中TRAIL、活化Caspase-8和活化Caspase-3的表達(dá)顯著升高。健康對照組經(jīng)TWS119處理后巨核細(xì)胞中TRAIL和活化Caspase-3表達(dá)也升高,而活化Caspase-8的表達(dá)升高但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A組Bcl-xL mRNA表達(dá)水平高于健康對照組,但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,A組Bcl-2 mRNA顯著高于對照組;加入TWS119處理后,Bcl-xL mRNA和Bcl-2 mRNA在A組和健康對照組的表達(dá)水平均明顯降低。TRAIL mRNA在A組的表達(dá)均顯著低于對照組;加入lμM TWS119后,A組和健康對照組中TRAIL的表達(dá)均明顯升高。Western blot結(jié)果顯示,蛋白水平上TRAIL、活化Caspase-8和活化Caspase-3在A組中的表達(dá)均低于健康對照組,加入lμM TWS119后,A組和對照組中TRAIL、活化Caspase-8和活化Caspase-3表達(dá)均有不同程度升高,Caspase-8和Caspase-3蛋白總量表達(dá)未見明顯變化。(5)TWS119治療有效減輕ITP模型小鼠血小板減少的相關(guān)癥狀。將SCID小鼠分為4組,a組僅接受射線輻照,無任何細(xì)胞轉(zhuǎn)輸;b組接受射線輻照,并于輻照當(dāng)日開始腹腔注射1mg/kg TWS119,之后隔天注射1次,注射兩周;c組接受腹腔注射CD61基因敲除小鼠脾細(xì)胞和射線輻照;d組接受同等劑量脾細(xì)胞、TWS119以及射線輻照。a組和b組小鼠血小板數(shù)目于第二周回升,提示射線輻照所致的一過性血小板減少恢復(fù),而接受脾細(xì)胞注射的c組和d組小鼠血小板計(jì)數(shù)在監(jiān)測期間維持在較低水平,則證明主動型ITP小鼠模型造模成功。d組小鼠血小板數(shù)目從第7天開始升高,從第14天開始明顯高于c組小鼠,提示腹腔注射TWS119能夠有效升高小鼠外周血小板數(shù)量,進(jìn)而提高小鼠的生存率。結(jié)論:(1)TWS119在體外能夠促進(jìn)巨核細(xì)胞的生成、成熟和血小板的釋放,并且TWS119對巨核細(xì)胞的作用呈劑量依賴性。(2)部分ITP患者血漿導(dǎo)致的巨核細(xì)胞成熟障礙及血小板生成不足與凋亡相關(guān)因子TRAIL的表達(dá)異常相關(guān),TWS119對其具有改善作用。低劑量TWS119可增加TRAIL表達(dá)水平,同時增加TRAIL的敏感性,促進(jìn)巨核細(xì)胞的生成、成熟和血小板的釋放。(3)TWS119改善了主動型ITP小鼠的血小板減少癥狀,提示TWS119有望成為ITP治療的新方法,同時對一些血小板減少相關(guān)疾病的治療提供了新思路。第二部分:抗c-Mpl抗體在ITP患者中抑制血小板生成和影響rhTPO療效的作用研究研究背景:原發(fā)免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia,ITP)是臨床最常見的自身免疫性出血性疾病(外周血小板計(jì)數(shù)100 ×l09/L),約占所有出血性疾病的30%。主要臨床特點(diǎn)包括外周血小板減少、體內(nèi)產(chǎn)生血小板自身抗體、伴骨髓巨核細(xì)胞數(shù)正�；蛟龆�。目前,ITP的發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)主要集中在血小板生成不足和血小板破壞增多兩部分。血小板破壞過多主要?dú)w因于細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)對血小板的直接溶解和/或自身抗體介導(dǎo)的血小板過度清除;而血小板生成不足則是由免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的巨核細(xì)胞成熟障礙和凋亡異常引起的。隨著對ITP發(fā)病機(jī)制的深入研究,由自身反應(yīng)性B細(xì)胞產(chǎn)生的自身抗體(例如白身血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa和Ib/IX抗原的自身抗體抗GP Ⅱb/IⅢa和抗GP Ib/IX),尤其是IgG型抗體與血小板膜表面的糖蛋白結(jié)合,致敏的血小板進(jìn)一步通過Fc受體被巨噬細(xì)胞吞噬或激活補(bǔ)體途徑而被破壞。血小板的大量破壞在正常生理情況下應(yīng)該會引起血小板代償性升高,但研究發(fā)現(xiàn)ITP患者的血小板生成中43%正常,30%甚至減少,而僅有27%表現(xiàn)出生成增多,此結(jié)果提示了血小板生成減少也參與了 ITP的發(fā)病進(jìn)程。Chang和McMillan等研究發(fā)現(xiàn),ITP患者血漿中的血小板特異性自身抗體能夠明顯抑制巨核細(xì)胞的生成,說明自身抗體不僅能夠介導(dǎo)外周血小板的過度破壞,還會影響骨髓中巨核細(xì)胞的生長發(fā)育。然而,大部分ITP患者骨髓中巨核細(xì)胞的數(shù)量正�；蛟龆�,所以抗血小板自身抗體導(dǎo)致的巨核細(xì)胞數(shù)量降低不能完全闡明外周血小板生成減少的原因。目前普遍認(rèn)為血小板的生成與巨核細(xì)胞成熟、凋亡密切相關(guān)。因此,巨核細(xì)胞凋亡異常也可能是導(dǎo)致ITP患者血小板持續(xù)減少的重要原因。此外,有研究發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)患者和ITP患者血清中檢測出抗c-Mpl抗體(anti-thrombopoietin receptor antibody,anti-TPO-R antibody)的存在,而健康者未被檢出,且抗c-Mp丨抗體的存在與外周血小板減少有一定相關(guān)性。我們推測抗c-Mpl抗體的存在可能是ITP患者血小板減少的原因之一。ITP經(jīng)典的一線治療包括糖皮質(zhì)激素和靜脈注射免疫球蛋白。近年來,盡管有新的治療方法出現(xiàn),如利妥昔單抗、促血小板生成素(thrombopoietin,TPO)和TPO受體激動劑等,但僅對2/3的患者有效,甚至更少數(shù)患者能夠達(dá)到長期緩解,其余患者治療無效或短期內(nèi)復(fù)發(fā),發(fā)展成為難治性ITP。TPO的作用機(jī)制是通過與巨核細(xì)胞表面TPO受體c-Mpl結(jié)合形成TPO/c-Mpl復(fù)合體,從而促進(jìn)巨核細(xì)胞分化、成熟和血小板生成。有研究報道,抗c-Mpl抗體陽性的患者血清TPO水平升高,因此推測可能抗c-Mpl抗體通過與TPO競爭性結(jié)合巨核細(xì)胞表面的c-Mpl,空間抑制作用導(dǎo)致TPO與c-Mpl無法結(jié)合,阻斷了 TPO/c-Mpl通路,使巨核細(xì)胞出現(xiàn)分化、發(fā)育、成熟障礙,從而導(dǎo)致血小板生成減少;同時,抗c-Mpl抗體也可能通過抗原抗體反應(yīng)消耗血小板,具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。目前,ITP在診斷上仍然缺乏特異性指標(biāo),往往以排除性診斷為主。本研究將通過探索抗c-Mpl抗體在rhTPO治療ITP中的效果,評估抗c-Mpl抗體的意義和價值,為ITP的診斷和rhTPO的臨床應(yīng)用提供一種有效的補(bǔ)充性的實(shí)驗(yàn)室檢查手段。目的:(1)檢測ITP患者血清中抗c-Mpl抗體水平,通過比較ITP患者與其他血小板減少疾病患者的抗c-Mpl抗體的差異,分析抗c-Mpl抗體作為ITP患者鑒別診斷的參考意義。(2)通過對比抗c-Mpl抗體陽性及陰性的ITP患者中抗血小板抗體、TPO水平及相關(guān)臨床指標(biāo)的差異,評價抗c-Mpl抗體在ITP診斷中的可行性及價值。(3)通過比較rhTPO、地塞米松、美羅華和艾曲波帕治療抗c-Mpl抗體陽性及陰性的慢性1TP患者的療效,評價抗c-Mpl抗體在預(yù)后中的價值。方法:(1)標(biāo)本收集:收集1 87例ITP患者(31例新診斷和156例慢性ITP),31例再生障礙性貧血(aplastic anemia,AA)患者,17例骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome,MDS)患者,22例風(fēng)濕類疾病(rheumatic disease,RD)患者,25例急性髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)和59例正常對照(healthy donor,HD)的外周血,分離血清備用。(2)采血時對ITP患者進(jìn)行人口學(xué)和臨床癥狀體征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。記錄患者年齡、性別、血小板計(jì)數(shù)和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果。并對患者的治療方式、治療反應(yīng)、治療后血液學(xué)檢查及預(yù)后進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì)。(3)樣本檢測:酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked immunoabsorbent assay,ELISA)檢測血清中抗c-Mpl抗體的表達(dá)量。(4)骨髓細(xì)胞學(xué)涂片檢測ITP患者骨髓中巨核細(xì)胞數(shù)量。(5)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測血清TPO水平。(6)改良單克隆抗體俘獲血小板抗原技術(shù)(Modified monoclonal antibody-specific immobilization of platelet antigens,MAIPA)檢測ITP患者血團(tuán)中血小板自身抗體。(7)CD34+細(xì)胞獲取:采集足月妊娠臍血80-100 mL,分離單個核細(xì)胞并從中分選出CD34+細(xì)胞,加入rhIL-3和SCF,體外培養(yǎng)于24孔板中,每孔加入100 ng rhTPO或10 ptM艾曲波帕,再加入ITP患者或健康對照的純化IgG。(8)流式細(xì)胞術(shù)檢測培養(yǎng)體系中巨核細(xì)胞的數(shù)量及凋亡比例、血小板生成數(shù)量以及多倍體巨核細(xì)胞比例。結(jié)果:(1)在不同的血小板減少性疾病中可以檢測到抗c-Mpl抗體。通過檢測59例正常對照的血清抗c-Mpl抗體水平,將抗體濃度高于2187.93 ng/mL的患者定義為抗c-Mpl抗體陽性的患者。在54例ITP(28.9%)、1例MDS(5.9%)、7例RD(31.8%)和2例AML(8%)患者的血清中檢測到抗c-Mpl抗體。然而,無論是正常對照組還是AA組,均未檢測到抗c-Mpl抗體。其中,ITP組抗c-Mpl抗體陽性患者的比例明顯高于MDS、AA組和AML組(尸0.05)。(2)ITP中,抗c-Mpl抗體陽性患者的骨髓巨核細(xì)胞數(shù)量和外周血小板計(jì)數(shù)較抗c-Mpl抗體陰性患者降低。結(jié)果顯示,在ITP患者中,抗c-Mpl抗體陽性組的外周血小板計(jì)數(shù)明顯低于抗c-Mpl抗體陰性組(P=0.01)�？筩-Mpl抗體陽性組的骨髓巨核細(xì)胞數(shù)量較抗c-Mpl抗體陰性組顯著減少(尸=0.004)�？筩-Mpl抗體陽性組中,其抗GP Ib/IX抗體和抗GP Ilb/IIla抗體雙陽性的比例高于抗c-Mpl抗體陰性患者(P=0.001)。ITP患者中,31例為新診斷的ITP,其中14例為抗c-Mpl抗體陽性。156例為慢性ITP患者,其中40例為抗c-Mpl抗體陽性。新診斷組的抗c-Mpl抗體陽性患者的比例高于慢性ITP組(尸=0.049)。(3)ITP中,抗c-Mpl抗體陽性患者血清TPO水平升高。AA組的血清TPO水平高于ITP,MDS,AML和RD組,而健康對照組的血清TPO水平表達(dá)最低(P均0.05)。此外,抗c-Mpl抗體陽性患者的TPO 水平高于抗c-Mpl抗體陰性組(尸=0.004)。(4)抗c-Mpl抗體陽性與rhTPO的療效減低相關(guān)。初次接受治療至第三個月結(jié)束時,54例抗c-Mp1抗體陽性的患者中,有27(50%)例接受了 rhTPO的治療,其中14(51.9%)例達(dá)到了臨床完全反應(yīng)(complete response,CR)和有效(response,R)。133例抗c-Mpl抗體陰性的患者中,83(62.4%)例接受了 rhTPO的治療,其中62(74.7%)例獲得臨床CR和R。抗c-Mpl抗體陰性的患者對rhTPO的有效率高于抗c-Mpl抗體陽性組(尸=0.03)。使用Logistic回歸模型分析了抗c-Mpl抗體與治療效果的相關(guān)性,結(jié)果表明抗c-Mpl抗體的存在與rhTPO治療后臨床反應(yīng)的效果呈負(fù)相關(guān)。經(jīng)rhTPO治療達(dá)到CR和R的患者中,抗體陽性組中位起效時間為16天,抗體陰性組為9天(P ＝ 0.009)。然而,在地塞米松或美羅華治療組中,抗c-Mpl抗體陽性和陰性患者的治療效果無顯著差異(P0.05)。此外,經(jīng)艾曲波帕治療的ITP患者中,3例抗c-Mpl抗體陽性且血清抗c-Mpl抗體水平高表達(dá)的患者中2例治療無效(NR),而2例抗c-Mpl抗體陰性的患者治療后均達(dá)到CR。(5)ITP患者經(jīng)rhTPO治療后血清抗c-Mpl抗體表達(dá)水平降低。19例經(jīng)rhTPO治療后患者的抗c-Mpl抗體滴度水平顯著低于治療前的抗體滴度水平(尸= 0.044)。而經(jīng)美羅華、地塞米松和艾曲波帕治療后患者的抗c-Mpl抗體滴度水平較治療前無顯著差異。(6)抗c-Mpl抗體陽性的ITP患者血清純化IgG可以抑制體外巨核細(xì)胞和血小板生成。在rhTPO或艾曲波帕存在下的培養(yǎng)體系,均可發(fā)現(xiàn)抗c-Mpl抗體陽性組的巨核細(xì)胞生成較抗c-Mpl抗體陰性組顯著降低。此外,抗c-Mpl抗體陽性組的血小板生成亦明顯低于抗c-Mpl抗體陰性組。在rhTPO存在下,抗c-Mpl抗體陽性組與抗c-Mpl抗體陰性組相比,多倍體比例較低。而在艾曲波帕處理下,我們并沒有在此兩組之間觀察到明顯差異。此外,無論在rhTPO或者艾曲波帕處理下,抗c-Mpl抗體陽性組和陰性組之間在巨核細(xì)胞凋亡比例上沒有顯著差異。與健康對照組相比,抗c-Mpl抗體陽性組在巨核細(xì)胞生成、凋亡比例和血小板生成數(shù)量上均明顯降低。這些結(jié)果提示,即使存在促血小板生成劑,ITP患者中抗c-Mpl抗體存在可能對巨核細(xì)胞生成和血小板產(chǎn)生具有抑制作用。結(jié)論:(1)在ITP患者中可以檢測到抗c-Mpl抗體,但在正常人中均未檢測到,抗c-Mpl抗體有望成為ITP的臨床診斷指標(biāo)之一。(2)抗c-Mpl抗體陽性的ITP患者巨核細(xì)胞和血小板計(jì)數(shù)下降,血清TPO水平升高。同時在體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了抗c-Mpl抗體對巨核細(xì)胞和血小板生成的抑制作用,提示抗c-Mpl抗體可能參與ITP的病理生理過程。(3)抗c-Mpl抗體的存在與rhTPO療效降低有關(guān),rhTPO治療有效的患者經(jīng)治療后血清抗c-Mpl抗體表達(dá)水平降低。提示抗c-Mpl抗體可能會影響rhTPO治療的療效,對ITP的臨床藥物治療提供新思路。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R558.2
【圖文】：

圖１．邋ＴＷＳ１１９在體外能夠促進(jìn)巨核細(xì)胞成熟、凋亡和血小板釋放，并呈濃度依逡逑賴性。逡逑圖邋Ａ：不同濃度邋ＴＷＳ１１９邋（０，Ｏ．ｌｕＭ，邋０．５（ｉＭ，ｌｐＭ，ｌ0ｎＭ，邋５0ｎＭ，ｌＯＯｐＭ）逡逑作用下培養(yǎng)體系的巨核細(xì)胞生成數(shù)量依次為７．００邋士邋１．３３邋ｘ邋ｌ0５，邋８．０２邋±邋１．９１邋ｘ邋ｉ0５，逡逑８．９０±２．０４邋ｘ邋ｉ0５，邋ｉｉ．８６±２．０７邋ｘ邋ｉ0５，邋ｉｉ．３２±２．］６邋ｘ邋ｉ0５，邋９．１７±０．９９邋ｘ邋ｉ0５，邋５．２９士逡逑０．９３ｘｌ0５。ＴＷＳ１１９邋１ｐＭ邋時巨核細(xì)胞數(shù)量高于邋０．５ｈＭ邋（尸＜０．０５）。逡逑圖邋Ｂ：不同濃度邋ＴＷＳ１１９邋（０，Ｏ．ｌｕＭ，０．５ｎＭ，ｌｐＭ，邋］0ｎＭ，５０ｐＭ，１００ｐＭ）逡逑作用下血小板生成數(shù)量依次為５．９４邋±１．９７邋ｘ邋ｌ0４，７．５１邋±１．８４邋ｘ邋ｌ0４，８．９４邋±１．３７邋ｘ逡逑１０４，１２．７７邋±３．１２邋ｘ邋１0４，１１．４５邋±３．０７邋ｘ邋１0４，６．６１邋±邋１．９２邋ｘ邋１0４，４．３０邋±邋１．８１邋ｘ邋１0４。逡逑ＴＷＳ１１９�。蜁r血小板生成數(shù)量高于０．５ｐＭ邋（尸＜邋０．０５邋）。逡逑

３．邋ＴＷＳ１１９對正常對照和部分ＩＴＰ血漿培養(yǎng)巨核細(xì)胞成熟和血小板釋作用。逡逑Ａ：加入ＴＷＳ１１９邋１ｆｉＭ后，健康對照組（對照組ｕｓ．對照組＋ＴＷＳ１１９，０．７９ｘ邋ｌ0５ＶｌＳ．６．０３±０．７0ｘ邋１0５，？尸＜邋0．0１）和Ａ組的巨核細(xì)胞生成數(shù)量．Ａ邋組邋＋ＴＷＳ１１９，７．１２±０．９２ｘｌ0５ｖ＞ｓ．８．０３邋土邋１．２５＞＜１0５，尸邋＜邋0．0１）顯著８：加入�。埽ぃ福保保瑰澹保溃春�，健康對照組（２．６７±０．８７＞＜１0＼１５．３．４６±０．９６＞＜＜邋０．０１）和邋Ａ邋組的血小板生成數(shù)量（１．６６邋±０．８０邋ｘｌ0４ＶｌＳ．邋２．２６邋±０．８９邋ｘｌ0４０１）顯著升高。逡逑邋Ｃ：加入邋ＴＷＳ１１９邋１邋ｎＭ邋后，健康對照組（２０．０８％邋士邋４．９４％邋ｖｓ．邋２３．８０％邋±４．７＜邋０．０５）和Ａ組的巨核細(xì)胞凋亡比例（１３．９９％邋±４．４５％邐１８．４７％邋±６．２＜邋０．０１）顯著升高。逡逑Ｄ、圖Ｅ：加入ＴＷＳ１１９邋ｌ｜ｕＭ后，Ａ組的巨核細(xì)胞多倍體比例（２邋４Ｎ，邋４

本文編號：2729442