【摘要】：心力衰竭(Heart failure,HF)是由各種疾病引發(fā)的心肌收縮功能減弱,使心臟泵出的血液量減少,無法搏出靜脈回流和身體組織代謝需要的血液供應,以及由此產(chǎn)生的一系列癥狀和體征,是各種心血管疾病的共同結局。壓力負荷過重是導致心力衰竭的重要原因。在正常的情況下,心臟的大部分能量來源于脂肪酸氧化,但是在心衰發(fā)生時,心肌細胞的能量代謝過程發(fā)生明顯的變化,脂肪酸的代謝也出現(xiàn)明顯異常。同時,心臟脂肪酸β氧化的改變能夠導致心肌能量代謝異常,與心力衰竭的發(fā)生密切相關。目前,細胞內(nèi)脂滴(Lipid droplets,LD)目前被認為是一個參與能量代謝的“細胞器”,能夠儲存脂質并在脂質代謝過程中起著非常重要的作用,與很多代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展有關。脂滴中的脂滴表面蛋白是一類參與脂滴代謝調(diào)節(jié)的分子,其中,PAT家族最為重要,Plin5是現(xiàn)階段發(fā)現(xiàn)的第5個PAT家族的成員,主要表達于氧化代謝比較活躍的組織中,例如心臟、肝臟、骨骼肌和褐色脂肪組織(Brown Adipose Tissue,BAT)等,又被稱為MLDP(Myocardial lipid droplet protein)、LSDP5(Lipid storage droplet protein5)、Perilipin 5,或OXPAT。Plin5在心臟組織中表達水平最高,Plin5缺失能夠加快脂解作用以及脂肪酸氧化速度,從而造成心臟和肝臟的脂毒性損傷。本實驗在Plin5敲除小鼠模型的基礎上,通過升主動脈縮窄術(Transverse aortic constriction,TAC),建立心衰的動物模型,來研究Plin5在壓力負荷性心衰發(fā)生過程中的作用及可能的分子機制,為心衰的治療提供參考。1、Plin5缺失加重TAC誘導的小鼠心肌肥大以及心臟功能的下降。8周齡的野生型和Plin5敲除小鼠分別進行升主動脈縮窄術(TAC)。術后四周取各組小鼠心臟,計算小鼠心臟重量(Heart weight,HW)/小鼠整體重量(Body weight,BW)。同時,對小鼠心臟進行HE染色,采用Cell Sens Entry軟件隨機選擇5個不同視野,計算心肌細胞橫截面積。結果顯示,TAC術后,Plin5敲除小鼠HW/BW相比野生組明顯升高,而且Plin5敲除小鼠心肌細胞橫截面積相比野生組明顯增大。這些結果提示,Plin5缺失加劇TAC誘導的小鼠心肌肥厚。TAC術后四周,應用超聲儀及高頻探頭行經(jīng)胸二維心臟超聲檢查(M模式)獲得野生型和Plin5敲除小鼠的心動圖,分別測定左室收縮末期內(nèi)徑(Left ventricular systolic internal dimension,LVID;S),左室射血分數(shù)(Ejection fraction,EF),左心室短軸縮短率(Fraction shortening,FS)。結果顯示,Plin5缺失加劇TAC誘導的左心室收縮末期心室腔擴張程度,并導致心臟功能明顯下降。2、Plin5缺失降低心臟中脂滴儲存降低,并增加了非酯化脂肪酸的水平。TAC術后四周,取各組心臟組織,行油紅O染色,結果顯示Plin5缺失小鼠心肌中脂滴含量明顯降低;心肌組織的甘油三酯(Triglyceride,TG)定量分析顯示,Plin5敲除小鼠導致心肌組織中TG含量明顯下降,而游離脂肪酸(FFA)的水平卻高于野生型小鼠,但野生型小鼠和Plin5敲除小鼠血清中FFA未出現(xiàn)明顯變化。TAC術后,小鼠心肌組織內(nèi)脂滴數(shù)量和TG含量,以及心肌組織和血中游離脂肪酸(FFA)水平也出現(xiàn)類似的變化。這些結果表明,Plin5缺失能夠降低心肌組織內(nèi)脂肪的儲積,而增加游離脂肪酸水平。3、Plin5缺失導致小鼠心肌組織中線粒體數(shù)量增多,并且加劇TAC術后的心肌過氧化損傷。取TAC術后四周小鼠心室組織,利用透射電鏡觀察心肌組織超微結構,結果發(fā)現(xiàn),Plin5缺失增加小鼠心肌細胞中的線粒體數(shù)量,而且TAC術后Plin5缺失小鼠心肌細胞中線粒體數(shù)量也明顯多于野生型小鼠,盡管TAC術造成心肌細胞線粒體數(shù)量的減少。Western Blot結果顯示,線粒體中重要分子Cox IV以及Cytochrome C水平升高,且Real-time PCR也顯示Cox IV以及Cytochrome C m RNA水平升高,表明線粒體數(shù)量增加,與電鏡觀察的結果一直。TAC術后,Plin5敲除小鼠的心肌組織中Cox IV和Cytochrome C的蛋白和m RNA水平均出現(xiàn)降低,與野生型小鼠類似。以上結果說明,Plin5缺失能夠增加心肌組織中線粒體的數(shù)量。TAC術后4周,取各組小鼠心臟組織,檢測各組小鼠心肌組織中的MDA,SOD以及ROS水平。研究結果發(fā)現(xiàn),在假手術組中,Plin5缺失小鼠心臟組織中MDA含量略高于野生小鼠,而TAC術后Plin5缺失心肌組織中MDA水平明顯升高;在假手術組,Plin5缺失小鼠心肌內(nèi)SOD的活性沒有明顯差異,而在TAC術后Plin5缺失小鼠心臟組織中SOD活性明顯降低;在假手術組中,盡管Plin5缺失小鼠心肌組織ROS含量相對于野生型小鼠沒有明顯變化,但在TAC術后,Plin5缺失小鼠心臟組織中ROS含量明顯高于野生小鼠。結果表明,Plin5缺失加劇了TAC導致的心臟過氧化損傷。4、Plin5缺失加劇了TAC引起的小鼠心肌中PGC-1α與PPARα表達水平升高的程度。TAC術后4周,取各組心室組織,Western Blot測定各組小鼠心肌中PGC-1α與PPARα的表達水平,結果顯示,TAC術后,Plin5敲除和野生型小鼠心肌中PGC-1α與PPARα的表達水平相比假手術組均有明顯升高,而Plin5敲除小鼠的升高更加顯著。同時,Real-time PCR檢測Plin5敲除和野生型小鼠心肌中PGC-1α與PPARα表達水平,發(fā)現(xiàn)結果與Western Blot基本一致。這些結果顯示,TAC術后,小鼠心肌中PGC-1α與PPARα的表達水平升高,同時,Plin5缺失加劇了TAC引起的小鼠心肌中PGC-1α與PPARα表達水平升高的程度。本研究利用升主動脈縮窄術(TAC)研究了Plin5敲除小鼠壓力負荷性心衰的發(fā)生過程,以明確Plin5在壓力負荷性心衰發(fā)生過程中的作用。研究結果顯示,Plin5缺失加劇TAC誘發(fā)的小鼠心肌肥厚程度以及左心室收縮末期心室腔的擴張,導致心臟功能下降。進一步的研究發(fā)現(xiàn),Plin5缺失降低了心臟中脂滴的儲存,并激活PPARα活性,增加線粒體數(shù)量,使脂肪酸的氧化速率加快。脂肪酸氧化速度的增加導致心肌細胞內(nèi)產(chǎn)生過量的ROS,從而導致心肌的脂毒性(Lipotoxicity)損傷,加快了TAC導致的小鼠心衰程度。這些結果提示,Plin5缺失小鼠心肌中脂滴含量明顯減少,刺激PGC-1α以及PPARα表達水平升高,從而調(diào)節(jié)脂肪酸氧化中的關鍵分子,使線粒體增值,脂肪酸氧化速度加快,產(chǎn)生大量的ROS,進而引發(fā)心肌細胞的氧化損傷,加重TAC導致的心臟損傷。這些結果對明確Plin5在心肌中的功能,以及脂肪代謝異常在心衰發(fā)生過成匯總的作用具有重要的意義。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R541.6

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