【摘要】：目的:利用肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae,C.pneumoniae)體外感染血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)模型,觀察C.pneumoniae在入侵VSMC過程中Toll樣受體2(Toll-like receptor 2,TLR2)和C-X-C趨化因子受體4(C-X-C chemokine receptor type 4,CXCR4)的相互作用,證實(shí)C.pneumoniae經(jīng)TLR2通過CXCR4-β-arrestin 2通路入侵VSMC。方法:1.C.pneumoniae增殖培養(yǎng)后體外感染VSMC;2.采用Western blot技術(shù)檢測(cè)C.pneumoniae感染VSMC后TLR2、CXCR4和CXCR7蛋白表達(dá)水平;3.Western blot技術(shù)分別檢測(cè)C.pneumoniae感染VSMC后TLR2、CXCR4和CXCR7細(xì)胞膜和胞漿部分的蛋白表達(dá)水平;4.激光掃描共聚焦顯微鏡觀察C.pneumoniae感染VSMC后TLR2、CXCR4和CXCR7蛋白分布情況;5.應(yīng)用RNA干擾技術(shù)分別使TLR2、CXCR4、CXCR7和β-arrestin 2表達(dá)水平下調(diào),Western blot檢測(cè)這些蛋白表達(dá)水平以確定干擾效能;6.應(yīng)用RNA干擾技術(shù)使TLR2、CXCR4、CXCR7和β-arrestin 2表達(dá)水平下調(diào),免疫熒光染色法觀察VSMC的C.pneumoniae感染率;7.激光掃描共聚焦顯微鏡觀察C.pneumoniae感染VSMC后TLR2和CXCR4、TLR2和CXCR7的共定位;8.免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)C.pneumoniae感染VSMC后TLR2和CXCR4、TLR2和CXCR7的互相作用;9.鄰位連接(proximity ligation assay,PLA)技術(shù)觀察C.pneumoniae感染VSMC后TLR2和CXCR4、TLR2和CXCR7的互相作用;10.PLA技術(shù)觀察C.pneumoniae感染VSMC后CXCR4對(duì)β-arrestin2的募集作用;11.應(yīng)用RNA干擾技術(shù)使TLR2表達(dá)水平降低,Western blot檢測(cè)C.pneumoniae感染引起的CXCR4蛋白分布的變化;12.應(yīng)用RNA干擾技術(shù)使TLR2表達(dá)水平降低,PLA技術(shù)觀察C.pneumoniae感染對(duì)CXCR4募集β-arrestin 2作用的影響。結(jié)果:1.C.pneumoniae感染VSMC后15min TLR2蛋白表達(dá)水平開始升高,持續(xù)至C.pneumoniae感染VSMC后30 min、60 min、120 min和180 min,與正常對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);2.C.pneumoniae感染VSMC后60 min,細(xì)胞膜上TLR2的表達(dá)水平升高,與正常對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而在感染后180 min,細(xì)胞膜上TLR2的表達(dá)恢復(fù)至正常水平。胞漿中TLR2的表達(dá)水平在C.pneumoniae感染VSMC后60 min降低,與正常對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),感染后180 min胞漿中TLR2的表達(dá)水平又恢復(fù)至正常水平;激光共聚焦顯微鏡觀察TLR2蛋白的分布情況和上述結(jié)果一致;3.與C.pneumoniae+scr RNA組相比,C.pneumoniae+TLR2 si RNA組感染率降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);4.C.pneumoniae感染VSMC后CXCR4蛋白表達(dá)水平與感染前相比無顯著變化;C.pneumoniae感染VSMC后15 min,細(xì)胞膜上CXCR4的表達(dá)水平開始升高,感染后60 min細(xì)胞膜上CXCR4的表達(dá)水平達(dá)到最高,感染后180 min細(xì)胞膜上CXCR4的表達(dá)水平有所降低但仍高于正常水平,與正常對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。而胞漿中CXCR4的表達(dá)水平在C.pneumoniae感染VSMC后15 min降低,一直持續(xù)至感染后180 min,與正常對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);激光共聚焦顯微鏡觀察CXCR4蛋白分布情況和上述結(jié)果一致;5.與C.pneumoniae+scr RNA組相比,C.pneumoniae+CXCR4 si RNA組感染率降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);6.C.pneumoniae感染VSMC后15 min CXCR7蛋白表達(dá)水平開始升高,感染后30 min、60 min、120 min和180 min均明顯高于感染前,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);C.pneumoniae感染VSMC后15 min,細(xì)胞膜上CXCR7的蛋白表達(dá)水平開始升高,感染后60 min細(xì)胞膜上CXCR7的蛋白表達(dá)水平降低至正常水平之下,感染后180 min細(xì)胞膜上CXCR7的表達(dá)水平又再次升高,與正常對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。而胞漿中CXCR7的蛋白水平在C.pneumoniae感染VSMC后15 min升高,持續(xù)至感染后180 min,與正常對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);激光共聚焦顯微鏡觀察CXCR7蛋白分布情況和上述結(jié)果一致;7.與C.pneumoniae+scr RNA組相比,C.pneumoniae+CXCR7 si RNA組感染率降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);8.激光掃描共聚焦顯微鏡、免疫共沉淀技術(shù)和PLA技術(shù)結(jié)果顯示C.pneumoniae感染VSMC后TLR2和CXCR4的相互作用明顯增強(qiáng),而TLR2和CXCR7的相互作用無顯著變化;9.PLA技術(shù)結(jié)果顯示C.pneumoniae感染VSMC后CXCR4對(duì)β-arrestin 2的募集作用增強(qiáng);10.與C.pneumoniae+scr RNA組相比,C.pneumoniae+β-arrestin 2 si RNA組感染率降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);11.沉默TLR2的表達(dá)后,C.pneumoniae+TLR2 si RNA組細(xì)胞膜上和胞漿中CXCR4的蛋白表達(dá)水平無顯著變化;由C.pneumoniae誘導(dǎo)的CXCR4對(duì)β-arrestin 2的募集作用明顯減弱。結(jié)論:C.pneumoniae通過增強(qiáng)TLR2和CXCR4的相互作用入侵VSMC;C.pneumoniae可能經(jīng)TLR2通過CXCR4-β-arrestin 2通路入侵VSMC。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R54
【圖文】：

天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文 一、C. pneumoniae 經(jīng) TLR2 入侵 VSMC用 Least-significant Differece（LSD）檢驗(yàn)。P ＜ 0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1.2 結(jié)果1.2.1 C. pneumoniae 感染使 VSMC TLR2 蛋白表達(dá)增多Western blot 結(jié)果顯示，75 kD~100 kD 之間靠近 100 kD 處有蛋白條帶，與TLR2 的分子量 95 kD 基本相符。如圖 1 所示，TLR2 的蛋白表達(dá)水平在 Cpneumoniae 感染 VSMC 后 15 min 即開始升高，感染后 30 min、60 min、120 mi和 180 min 均明顯高于正常對(duì)照組，使用 Image_J 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，感染后各時(shí)間點(diǎn) TLR2 的表達(dá)水平與正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05（圖 2）。而感染后各時(shí)間點(diǎn)之間的 TLR2 蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

C. pneumoniae 感染使 VSMC TLR2 蛋白表達(dá)增多estern blot 結(jié)果顯示，75 kD~100 kD 之間靠近 100 kD 處有蛋白條 的分子量 95 kD 基本相符。如圖 1 所示，TLR2 的蛋白表達(dá)水平oniae 感染 VSMC 后 15 min 即開始升高，感染后 30 min、60 min、 min 均明顯高于正常對(duì)照組，使用 Image_J 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析間點(diǎn) TLR2 的表達(dá)水平與正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜）。而感染后各時(shí)間點(diǎn)之間的 TLR2 蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意圖 1 C. pneumoniae 感染對(duì) VSMC TLR2 蛋白表達(dá)水平的影響

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2726121