【摘要】：研究背景與目的:隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,心血管事件發(fā)生呈逐年遞增的趨勢(shì)。其中,高致死、高致殘的急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)已成為導(dǎo)致人類死亡的首要病因。急性心肌梗死(AMI)是指冠狀動(dòng)脈急性、持續(xù)性缺血血氧所引起的心肌壞死,為了對(duì)抗這個(gè)心肌梗死,人類已經(jīng)從不同方向上進(jìn)行探索。例如鑒于心肌細(xì)胞無法生長的特性,干細(xì)胞方向的研究就是尋求形成新的心肌細(xì)胞來補(bǔ)充心梗后梗死區(qū)域死亡的心肌細(xì)胞,以期進(jìn)一步恢復(fù)心功能,改善患者預(yù)后。另一個(gè)方向就是針對(duì)心梗后邊緣區(qū)域的瀕死狀態(tài)的心肌細(xì)胞的拯救,通過研究某些特殊非編碼RNA或蛋白質(zhì)的功能來拯救瀕死狀態(tài)心肌細(xì)胞,減小梗死區(qū)域范圍是其中較為新穎的研究方向。長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lnc RNA)是一組轉(zhuǎn)錄物長度大200個(gè)nt(核苷酸),缺少特異完整開放閱讀框并且無蛋白質(zhì)編碼功能的RNA。研究發(fā)現(xiàn),長鏈非編碼RNA通過調(diào)控組蛋白修飾、染色質(zhì)重構(gòu)、轉(zhuǎn)綠水平以及轉(zhuǎn)綠后水平等方式,在細(xì)胞周期、增殖、遷移和代謝等方面發(fā)揮重要作用,近年關(guān)于lnc RNA的研究已然成為各個(gè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。近年來,多項(xiàng)研究成果都表明lnc RNA對(duì)急性心梗等多種心血管疾病具有調(diào)控作用。Morrbid(myeloid RNA regulator of Bim-induced death)是2016年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的與細(xì)胞死亡相關(guān)的lnc RNA而且人鼠同源,但在心血管領(lǐng)域并沒有任何與Morrbid相關(guān)的研究成果發(fā)表。通過前期對(duì)乳鼠原代心肌細(xì)胞以及HCM細(xì)胞內(nèi)Morrbid表達(dá)量等的探索性研究,認(rèn)為Morrbid可能對(duì)心肌細(xì)胞的死亡也具有一定的調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?(1)通過q PCR技術(shù)探究Morrbid在C57小鼠急性心梗模型中的表達(dá)。(2)通過q PCR技術(shù)探究Morrbid在人與小鼠心肌細(xì)胞缺氧模型中的表達(dá)趨勢(shì)。(3)在細(xì)胞層面調(diào)控Morrbid表達(dá),觀察其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。(4)在野生型C57小鼠體內(nèi)調(diào)控Morrbid表達(dá),觀察其對(duì)急性心梗后心功能的影響。(5)在敲除Morrbid基因的小鼠上觀察Morrbid-KO后其對(duì)急性心梗后心功能的影響。(6)通過數(shù)據(jù)庫篩選,尋找Morrbid可能的上下游基因。(7)在乳鼠原代心肌細(xì)胞缺氧模型與C57小鼠急性心梗模型中通過q PCR與Western blot技術(shù)驗(yàn)證下游基因的可靠性。(8)在調(diào)控后的人與小鼠細(xì)胞樣本上通過q PCR與Western blot技術(shù)驗(yàn)證下游基因的可靠性。(9)在調(diào)控后的C57小鼠心臟與敲除Morrbid基因的小鼠心臟上驗(yàn)證下游基因的可靠性。(10)用乳鼠原代心肌細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證上下游基因的可靠性。材料與方法:實(shí)驗(yàn)用購買自美國模式培養(yǎng)物集存庫,(American Type Culture Collection,ATCC)的人類心肌細(xì)胞(Human Cardiac Myocyte,HCM),購買自Jackson Lab的C57小鼠和C57乳鼠原代心肌細(xì)胞(Neonatal Mouse Cardiomyocyte,NMC),以及購買自北京百奧賽圖公司的Morrbid-KO基因小鼠作為研究對(duì)象,采用q PCR技術(shù)檢測(cè)樣本中基因表達(dá)量的變化;通過Tunel染色觀察缺氧處理后各組細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化。通過B超測(cè)量各組小鼠急性心梗模型后心功能的變化,采用TTC與Evans blue雙染色的方法拍照心臟切片心梗區(qū)去危險(xiǎn)區(qū)的比值。同時(shí),對(duì)同一心臟組織進(jìn)行固定,做冰凍切片后,通過Tunel染色觀察各組心肌組織細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化。應(yīng)用Western blot技術(shù)驗(yàn)證下游基因在缺氧模型、心梗模型以及調(diào)控后樣本中的含量變化。結(jié)果:1.在小鼠急性心梗模型中,心梗組比Sham組Morrbid表達(dá)量明顯增高;在NMC細(xì)胞缺氧模型中Morrbid表達(dá)量在缺氧的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)都比未做缺氧處理的對(duì)照組(0h)有所升高;在HCM細(xì)胞的缺氧模型中,Morrbid的整體趨勢(shì)依然是上升的,缺氧48小時(shí)組Morrbid表達(dá)量比0h的對(duì)照組Morrbid表達(dá)量明顯增高。2.在NCM細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中,Morrbid上調(diào)組細(xì)胞凋亡率明顯低于對(duì)照組,Morrbid下調(diào)組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組,即Morrbid在NCM細(xì)胞凋亡模型中起抗凋亡作用。3.在小鼠急性心梗模型中,Morrbid上調(diào)組的心功能明顯優(yōu)于對(duì)照組,且Morrbid基因敲除組的心功能也明顯比對(duì)照組差;Morrbid上調(diào)組的I/A明顯小于對(duì)照組,Morrbid基因敲除組的I/A也明顯大于對(duì)照組;Morrbid上調(diào)組的心肌組織凋亡率明顯低于對(duì)照組,Morrbid基因敲除組的心肌組織凋亡率也明顯高于對(duì)照組。4.Morrbid下游基因Serpine1在小鼠急性心模型、NMC細(xì)胞H202損傷模型中,其表達(dá)量均與Morrbid表達(dá)量相一致。5.在小鼠體內(nèi)心肌注射腺病毒上調(diào)Morrbid后,下游基因Serpine1的表達(dá)也上調(diào),敲除Morrbid基因后,下游基因Serpine1的表達(dá)下降;同時(shí)在HCM細(xì)胞中用腺病毒調(diào)控Morrbid后,下游基因Serpine1的表達(dá)均出現(xiàn)相應(yīng)的變化,與小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相一致。6.在NCM細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中,上調(diào)Morrbid后,用Si RNA下調(diào)Serpine1,可以部分的阻斷Morrbid抗凋亡作用。7.在NCM細(xì)胞中,加入PI3K抑制劑LY294002處理,可以抑制Morrbid表達(dá)增高。結(jié)論:1.長鏈非編碼基因Morrbid在NMC細(xì)胞中起抗凋亡作用。2.長鏈非編碼基因Morrbid在小鼠急性心梗中對(duì)心功能具有保護(hù)作用。3.長鏈非編碼基因Morrbid的抗凋亡作用有部分是通過調(diào)控其下游基因Serpine1實(shí)現(xiàn)。
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R542.22
【圖文】：

圖4-B：第一行是加 GFP,但不缺氧組；第二行是加 GFP,缺氧組；第三行是是加 MB OVE缺氧組；（100 倍鏡圖像）0102030CON&MB SI RNAApoptosiscels(%)***Hypoxia-24hVehicleMorrbid-siRNA+++_+_

圖 4-D：第一行是 control 缺氧組；第二行是加 Morrbid siRNA 缺氧組；（100 倍鏡圖像5. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果5.1 心臟注射腺病毒調(diào)控 Morrbid，小鼠急性心梗模型后各項(xiàng)結(jié)果對(duì) 12 周齡的 C57 小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，一組注射 GFP 腺病毒，一組注射Morrbid over expression 腺病毒[76]，48 小時(shí)之后，結(jié)扎小鼠左前降支，構(gòu)建性心梗模型。建模 24 小時(shí)后，B 超檢測(cè)兩組小鼠心功能，取出心臟做 TTC 與伊文氏藍(lán)雙染色以及心肌組織 Tunel 染色。5.1.1 心臟注射腺病毒調(diào)控 Morrbid，小鼠急性心梗模型后 B 超結(jié)果急性心梗建模 24 小時(shí)后，B 超檢測(cè)兩組小鼠各項(xiàng)指標(biāo)，其中左室射血分?jǐn)?shù)，Morrbid over expression 組的 EF%值（37.91 ±1.872, n=20）明顯高于 GF組的 EF%值（26.3 ±1.385, n=24）且（P＜0.0001）；左室短軸縮短率，Morrover expression 組的 FS%值（18.05 ±0.9934, n=20）明顯高于 GFP 組的 FS%值（12.09 ±0.68, n=24）且（P＜0.0001）；左室舒張期內(nèi)徑，Morrbid over express組的 LVEDD 值（3.737 ±0.08455, n=20）明顯低于 GFP 組的 LVEDD（4.153

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本文編號(hào)：2722763