【摘要】：缺血性心臟病(Ischemic heart disease,IHD),如心肌梗塞,中風和外周血管疾病是全世界致死致殘最常見的原因之一,其組織損傷程度直接與血流程度以及缺血時間有關~([1])。藥物溶栓、經皮冠狀動脈介入治療以及冠狀動脈旁路移植術是目前IHD的重要治療手段,對于縮小心梗面積、改善心臟功能具有重要意義。然而,即使冠狀動脈血流改善,臨床上也有相當一部分患者的微血管灌注阻塞,慢性心功能受損,以及微血管損傷導致的擴張型心肌病。缺血/再灌注損傷(Ischemia/reperfusion injury,I/RI)是指因冠狀動脈血流恢復,導致微血管內皮障礙及心肌細胞損傷加重的一種現(xiàn)象。在接受再灌注治療的急性心肌梗死患者中,就約有30%發(fā)生這種現(xiàn)象~([2])。同時突然恢復血流也會導致一些微血管阻塞,這個現(xiàn)象稱為無復流現(xiàn)象~([3])。無復流導致患者預后變差,并與梗死區(qū)擴大、充血性心力衰竭和死亡增加相關~([4])。心肌I/R損傷發(fā)病的關鍵是微血管功能障礙,其中心肌微血管內皮細胞(Cardiac microvascular endothelial cells,CMECs)發(fā)揮重要作用~([5])。因此,了解CMECs在I/R過程中的作用機制可能為IHD提供新的治療方向。CMECs是位于微血管和血管壁之間的關鍵界面,具有調節(jié)組織液體平衡和提供生物體存活所需的必需營養(yǎng)素的重要功能,是心臟非心肌細胞的主要成分。先前已有研究證明再灌注誘導CMECs釋放可溶性促凋亡介質促進心肌細胞凋亡~([5]),這暗示CMECs在心肌I/R損傷期間觸發(fā)心肌細胞損傷中起關鍵作用。此外,在I/R過程中CMECs凋亡先于心肌細胞,且凋亡的心肌細胞圍繞在凋亡的CMECs周圍~([6]),以及在體外CMECs可以通過分泌IL、TNFα、MCP、ET以及Ang II等等細胞因子加重心肌損傷,同時也可以分泌一些生物活性物質保護心肌細胞,如NO。綜上,CMECs-心肌細胞的相互作用在心臟MI/RI中占有重要的地位,但其相互作用的具體作用機制尚不明確。本實驗建立CMECs-H9c2共培養(yǎng)模型,通過模擬缺血/再灌注損傷建立缺氧/復氧(Hypoxia/reoxygen-ation,H/R)模型,觀察H/R條件下CMECs、H9c2是否發(fā)生相互作用,并初步探討其作用機制。方法(1)大鼠I/R模型構建:大鼠沿左冠狀動脈前降支結扎1h再灌24h,且分別于術前術后取血留樣;HE染色,觀察大鼠心臟形態(tài)變化;TUNEL染色,觀察大鼠心臟組織損傷情況。(2)比較NO和ET-1在大鼠I/R組和sham組的表達:通過試劑盒檢測大鼠血清中NO、ET-1的表達情況。(3)CMECs的分離、鑒定:酶消化法分離得到CMECs,免疫熒光以及Matrigel基質膠誘導血管形成實驗鑒定CMECs。(4)CMECs/H9c2缺氧/復氧模型構建:利用低氧工作站分別建立CMECs、H9c2的缺氧/復氧模型,并檢測其相應指標。(5)CMECs對H9c2的作用:收集H/R后CMECs培養(yǎng)基上清,將其作用于H9c2,LDH、MTS和RT-PCR檢測CMECs對H9c2的作用;構建H9c2和CMECs共培養(yǎng)H/R體系,WB檢測H9c2凋亡相關蛋白的表達。(6)H9c2對CMECs的作用:收集H/R后H9c2細胞培養(yǎng)基上清,將其作用于H/R后的CMECs細胞,LDH、MTS、Transwell和RT-PCR檢測H9c2對CMECs的作用;建立H9c2和CMECs共培養(yǎng)H/R體系,RT-PCR檢測CMECs炎性因子表達變化,(7)初步探討H9c2與CMECs相互作用的機制:通過試劑盒檢測H/R前后CMECs細胞培養(yǎng)基上清中NO、ET-1的含量變化。結果(1)HE染色:大鼠I/R組心肌組織排列紊亂,血管受損,并伴有炎癥細胞浸潤;TUNEL染色:與sham組相比,I/R組梗死區(qū)心肌及血管內皮細胞TUNEL陽性信號明顯增強。(3)血清檢測NO和ET-1結果顯示:與sham組相比,模型組NO和ET-1的表達量均升高,但NO/ET-1下降。(4)成功建立成年大鼠CMECs分離、鑒定、體外擴增的穩(wěn)定平臺。(5)H/R后CMECs細胞培養(yǎng)基上清作用于H9c2后,MTS和LDH檢測結果顯示CMECs H/R后培養(yǎng)基上清促進H9c2的增長和減輕H9c2缺氧/復氧損傷;RT-PCR結果顯示CMECs H/R后培養(yǎng)基上清抑制H9c2 H/R后炎性相關因子的表達;WB檢測結果顯示H9c2與CMECs共培養(yǎng)H/R后凋亡相關蛋白的表達降低。(6)H/R后H9c2細胞培養(yǎng)基上清作用于CMECs后,MTS和LDH檢測結果顯示H9c2 H/R后培養(yǎng)基上清加重CMECs缺氧/復氧損傷;RT-PCR結果顯示H9c2 H/R后培養(yǎng)基上清促進CMECs缺氧/復氧后炎性因子的表達;Transwell結果顯示H9c2 H/R后培養(yǎng)基上清抑制CMECs的遷移。結論(1)大鼠I/R心臟組織梗死區(qū)心肌細胞和血管內皮細胞損傷加劇,血清中NO、ET-1表達異常;(2)CMECs缺氧/復氧后上清對H9c2起保護作用,H9c2與CMECs共培養(yǎng)缺氧/復氧后H9c2損傷減輕。(3)H9c2缺氧/復氧后上清加重CMECs缺氧/復氧損傷,CMECs與H9c2共培養(yǎng)缺氧/復氧后CMECs損傷加重。
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R54
【圖文】：

圖 3.1 大鼠心肌微血管內皮細胞分離流程圖3.2.2 CMECs 的傳代待體外誘導分化得到的心肌微血管內皮細胞長到 80%左右，用 PBS 洗三遍，加入5%的胰酶消化 10s 左右，在鏡下觀察，待細胞變圓還未漂起來時，用 20%FBS-CMECs基終止消化，輕柔吹打細胞，制成細胞懸液，移至離心管中，500g 離心 5min，用FBS-CMECs 培養(yǎng)基重懸細胞，1:3 傳代。3.2.3 CMECs 的復蘇與凍存（1） 細胞凍存：當細胞長至 80%左右，用胰酶把細胞消化下來移至 15mL 離心管500g 離心 5min，棄上清，用凍存液重懸細胞后轉移到標記有標簽的凍存管中，放存盒中 24 小時后放入液氮長期保存。（2） 細胞復蘇： 從液氮或者-80℃低溫冰箱取出細胞，迅速放入 37℃水浴鍋中融待完全融化后，在生物安全柜中將細胞移至 15mL 離心管中，500g 離心 5min，棄

4 實驗結果4 實驗結果4.1 成功建立大鼠心肌 I/R 模型4.1.1 TTC 染色鑒定大鼠心肌 I/R 模型Wistar 大鼠隨機分成兩組，缺血/再灌組（I/R 組）和 sham 組，I/R 組大鼠缺血灌 24h，sham 組為對照組，處理后進行 TTC 染色。如圖 4-1 所示：I/R 組心臟組織色梗死區(qū)，sham 組心臟組織無白色梗死區(qū)。結果說明：大鼠缺血/再灌（I/R）模型成功。

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