發(fā)布時間：2020-06-20 13:41

【摘要】：疫苗是預(yù)防流感流行的主要有效手段,現(xiàn)階段使用和在研的流感疫苗分為裂解滅活疫苗、亞單位疫苗和減毒活疫苗。流感減毒活疫苗(簡稱LAIV)以滴鼻方式接種,可引起包括體液免疫、粘膜免疫和細胞免疫在內(nèi)的更為持久的免疫保護。目前只有美國和俄羅斯以雞胚為基質(zhì)生產(chǎn)減毒活疫苗。雞胚生產(chǎn)疫苗存在卵清蛋白過敏和供應(yīng)周期長等缺點,尤其是LAIV生產(chǎn)過程沒有病毒滅活步驟,存在將雞源性傳染性病原體散播至人群的風(fēng)險。Vero細胞是WHO推薦用于人用生物制品生產(chǎn)的細胞基質(zhì),可通過發(fā)酵罐大規(guī)模培養(yǎng)。然而,Vero細胞對流感病毒不敏感,多數(shù)流感病毒不能在Vero細胞上連續(xù)傳代。國外雖然投入巨資開發(fā)Vero細胞流感疫苗,但全球仍未見以Vero細胞為培養(yǎng)基質(zhì)生產(chǎn)的LAIV問世。選育流感病毒Vero細胞冷適應(yīng)母本毒株對于LAIV的研發(fā)至關(guān)重要。國外僅見一株甲型冷適應(yīng)株A/Singapore/1/57ca(H2N2)的報道,乙型的尚未見報道。本實驗室經(jīng)過10多年的研究,成功選育出甲型和乙型Vero細胞冷適應(yīng)株A/Yunnan/1/2005Vca(H3N2Vca)、B/Yunnan/1/2011Vca(BVca)。經(jīng)鑒定,兩株病毒能夠在Vero細胞25℃穩(wěn)定傳代培養(yǎng),且具有冷適應(yīng)性(ca)、溫度敏感特性(ts)和減毒特性(att)等表型特征。我們將 H3N2Vca 和 BVca 的 8 個基因片段(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS)克隆至雙向表達載體PHW2000,篩選出能協(xié)同工作的8個質(zhì)粒,拯救的毒株能在Vero細胞25 ℃穩(wěn)定傳代培養(yǎng),且具備ca、ts和att特性,表明Vero細胞流感減毒母本株基因組庫構(gòu)建成功。按照6+2模式,將含H3N2Vca和BVca的6個內(nèi)部基因的PHW2000質(zhì)粒與含2013-2014年WHO推薦北半球季節(jié)性流感疫苗生產(chǎn)用毒株 A/ChristChurch/16/2010(H1N1)、A/Texas/50/2012(H3N2)、B/Massachusetts/2/2012(BY)的表面抗原基因 HA、NA 的 PHW2000 質(zhì)粒,共轉(zhuǎn)染293T細胞,拯救獲得了三株Vero細胞LAIV候選株:A/ChristChurch/16/2010Vca、A/Texas/50/2012Vca、B/Massachusetts/2/2012Vca。經(jīng)鑒定,重配毒株具有 ca、ts 和att特性,病毒形態(tài)輪廓清晰,為有囊膜病毒;蝕斑以及Western實驗證明重配毒株能在Vero細胞上較好的增殖;測序結(jié)果顯示,重配毒株在Vero細胞連續(xù)傳代過程中表面抗原基因HA、NA未發(fā)生實質(zhì)性改變。將Vero細胞在無血清培養(yǎng)基中傳代建立了無血清Vero細胞庫,液氮保存復(fù)蘇成活:以0.1MOI的病毒量接種1:2傳代無血清培養(yǎng)36 h的Vero細胞,在病毒維持液pH7.2-7.4、TPCK胰蛋白酶濃度0.8ug/ml時獲得較高的病毒產(chǎn)量。將工作種子批病毒在Vero細胞大規(guī)模培養(yǎng),病毒液經(jīng)濃縮及蔗糖密度梯度離心純化,得到單價病毒液的ca、ts及att等表型特征沒有改變。制成的三價LAIV滴鼻免疫小鼠,一免組免后28天抗H1N1、H3N2、BY抗體滴度分別為1:234.67、1:248.3和1:239.3;二免后抗體滴度繼續(xù)升高,在28天時抗H1N1、H3N2、BY抗體滴度分別:1:490.667、1:606.7和1:485.3;一免和二免組免后14d肺洗液sIgA含量分別為2217.6ng/ml和3329.5ng/ml。免疫雪貂后,血清抗體滴度高達1:2000,其IL-4、IL-6等細胞因子的含量均顯著高于陰性對照組。挑戰(zhàn)試驗證明Vero細胞三價LAIV能有效保護動物病毒感染。本研究首次在國際上構(gòu)建了甲型和乙型Vero細胞流感減毒株的基因組庫,并用于三價(四價)季節(jié)性LAIV病毒種子批的制備。后續(xù)制備的三價Vero細胞季節(jié)性LAIV具有較好的安全性和免疫保護效果。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R392
【圖文】：

兩組患者之間無明顯差異（具體見表１、表２）。兩組患者可溶性逡逑ＳＴ－２邋［９．邋０邋（７．邋３－２２．邋２）邋ｖｓ．邋１２．邋６邋（８．邋７－１８．邋０）邋ｎｇ／ｍｌ，蘆０．邋３７］和邋Ｇａｌ－３邋［７．邋２邋（６．２－９．邋９）逡逑ｖｓ．邋７．１（５．４＿８．７）邋ｎｇ／ｍｌ，Ｐ＝０．４５］濃度無差異（具體見圖１、圖２）。按照上述逡逑標準，將年齡、吸煙、體重指數(shù)、可溶性ＳＴ－２、Ｇａｌ－３和左心房內(nèi)徑納入到多因素逡逑分析，最終發(fā)現(xiàn)年齡是室間隔心肌切除術(shù)后房顫發(fā)生的獨立危險因素逡逑［０Ｒ＝１．邋０６５邋（９５％可信區(qū)間邋１．００７－１．邋１２６）

兩組患者之間無明顯差異（具體見表１、表２）。兩組患者可溶性逡逑ＳＴ－２邋［９．邋０邋（７．邋３－２２．邋２）邋ｖｓ．邋１２．邋６邋（８．邋７－１８．邋０）邋ｎｇ／ｍｌ，蘆０．邋３７］和邋Ｇａｌ－３邋［７．邋２邋（６．２－９．邋９）逡逑ｖｓ．邋７．１（５．４＿８．７）邋ｎｇ／ｍｌ，Ｐ＝０．４５］濃度無差異（具體見圖１、圖２）。按照上述逡逑標準，將年齡、吸煙、體重指數(shù)、可溶性ＳＴ－２、Ｇａｌ－３和左心房內(nèi)徑納入到多因素逡逑分析，最終發(fā)現(xiàn)年齡是室間隔心肌切除術(shù)后房顫發(fā)生的獨立危險因素逡逑［０Ｒ＝１．邋０６５邋（９５％可信區(qū)間邋１．００７－１．邋１２６）

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 周自強,胡大一,陳捷,張仁漢,李奎寶,趙秀麗;中國心房顫動現(xiàn)狀的流行病學(xué)研究[J];中華內(nèi)科雜志;2004年07期

本文編號：2722498