【摘要】：目的本課題組前期研究提示,來源于內(nèi)皮特異型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)第4內(nèi)含子的27堿基重復(fù)序列的27nt-miRNA可負(fù)反饋調(diào)控其宿主基因eNOS的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)。本研究擬通過慢病毒轉(zhuǎn)染建立27nt-miRNA高表達(dá)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),體外實(shí)驗(yàn)探究27nt-miRNA對(duì)HUVECs增殖、遷移和管腔形成的影響及分子機(jī)制;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究27nt-miRNA對(duì)雞胚絨毛尿囊膜(chicken chorioallantoic membrane,CAM)血管新生的影響,深入探討27nt-miRNA在心血管系統(tǒng)發(fā)育和心血管疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。方法1 HUVECs的培養(yǎng)及慢病毒轉(zhuǎn)染委托上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司根據(jù)相應(yīng)的miRNA序列設(shè)計(jì)、構(gòu)建27nt-miRNA、anti-27nt-miRNA及空白對(duì)照載體,經(jīng)PCR鑒定及DNA測(cè)序比對(duì)分析確定載體構(gòu)建成功后用慢病毒包裝載體形成27nt-miRNA、anti-27nt-miRNA及對(duì)照慢病毒液。將慢病毒分別轉(zhuǎn)染HUVECs后分為:27nt-miRNA高表達(dá)組、anti-27nt-miRNA組和對(duì)照組。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞綠色熒光表達(dá)強(qiáng)度并采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染效率確定27nt-miRNA細(xì)胞株建立情況。2 27nt-miRNA對(duì)HUVECs增殖、遷移和管腔形成的影響構(gòu)建27nt-miRNA、anti-27nt-miRNA及對(duì)照載體并包裝入慢病毒,分別轉(zhuǎn)染HUVECs后分為27nt-miRNA組、anti-27nt-miRNA組和對(duì)照組,采用四甲基偶氮唑鹽(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT)比色法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖能力;采用劃痕試驗(yàn)(Scratch test)檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移能力;采用人工基底膠(Matrigel)檢測(cè)各組細(xì)胞的體外管腔形成能力。3 27nt-miRNA對(duì)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞eNOS及轉(zhuǎn)錄因子Sp1表達(dá)的影響構(gòu)建27nt-miRNA過表達(dá)、anti-27nt-miRNA及對(duì)照載體并包裝入慢病毒,分別轉(zhuǎn)染HUVECs后分為:27nt-miRNA高表達(dá)組、anti-27nt-miRNA組和對(duì)照組,采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測(cè)eNOS及Sp1的mRNA表達(dá)水平;采用免疫細(xì)胞化學(xué)法(Immunocytochemistry)及免疫印跡試驗(yàn)(Western blotting)檢測(cè)eNOS及Sp1的蛋白表達(dá)情況;采用一步法檢測(cè)細(xì)胞及培養(yǎng)液中一氧化氮(nitric oxide,NO)的濃度。4探究27nt-miRNA對(duì)CAM血管新生的影響構(gòu)建27nt-miRNA高表達(dá)、anti-27nt-miRNA及對(duì)照載體并包裝入慢病毒,采用CAM模型轉(zhuǎn)染相應(yīng)慢病毒后分為:27nt-miRNA高表達(dá)組、anti-27nt-miRNA組和對(duì)照組,觀測(cè)各組CAM血管面積占總CAM面積的百分比。結(jié)果1熒光顯微鏡下可見轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞綠色熒光較強(qiáng),細(xì)胞狀態(tài)良好,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明27nt-miRNA高表達(dá)組、anti-27nt-miRNA組和空白對(duì)照組的慢病毒轉(zhuǎn)染效率均達(dá)到90%以上,細(xì)胞株構(gòu)建成功。2與對(duì)照組比較,27nt-miRNA組HUVECs增殖活性明顯下降(P0.05),遷移率降低(P0.05),且未見明顯管腔樣結(jié)構(gòu)形成。3與對(duì)照組相比,27nt-miRNA組HUVECs內(nèi)eNOS和Sp1的mRNA(P0.05)與蛋白表達(dá)明顯降低(P0.05),NO產(chǎn)量下降(P0.05)。4相比對(duì)照組,27nt-miRNA組的CAM血管新生面積降低(P0.05)。結(jié)論1 27nt-miRNA顯著抑制體外HUVECs增殖、遷移和成管能力。2 27nt-miRNA顯著抑制HUVECs的eNOS和Sp1的mRNA和蛋白表達(dá),27nt-miRNA可能協(xié)同Sp1調(diào)控eNOS的表達(dá)進(jìn)而影響HUVECs的細(xì)胞功能,包括增殖、遷移和成管能力。3 27nt-miRNA顯著抑制CAM血管新生。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R54
【圖文】：

序列即 27nt-miRNA 的序列：5′-GAAG-3′、27nt-miRNA 反義序列及隨機(jī)對(duì)AGACGAG-3′分別設(shè)計(jì) 27nt-miRNA、用 PCR 技術(shù)獲取目的基因，通過基因基因分別克隆到 GV367 載體中，載體GFP-IRES-puromycin）如圖 1-1，其中7nt-miRNA、對(duì)照序列），接著 PCR 及用慢病毒包裝相應(yīng) GV367 載體形成照慢病毒。GV367 載體含增強(qiáng)綠色熒光rotein, EGFP）標(biāo)記及嘌呤霉素抗性（達(dá) EGFP，發(fā)出綠色熒光，同時(shí)，可用。

2019 屆碩士學(xué)位論文 27nt-miRNA 對(duì) HUVECs 管腔形成和 CAM 血管新生的影響及相關(guān)機(jī)制研究3 結(jié)果3.1 鏡下觀察 HUVECs 形態(tài)及慢病毒轉(zhuǎn)染情況正常 HUVECs 的生長(zhǎng)狀態(tài)良好，鏡下呈橢圓或多角形，部分為短梭型，如鋪路石樣單層排列。剛復(fù)蘇的細(xì)胞貼壁存活率不高且生長(zhǎng)速度較緩慢，隨著生長(zhǎng)環(huán)境的改善，細(xì)胞的生長(zhǎng)速度加快，達(dá)到 90%的密度后，細(xì)胞體積縮小，邊緣較亮，形態(tài)為橢圓形或圓形。慢病毒轉(zhuǎn)染 48 h 后用嘌呤霉素篩選，轉(zhuǎn)染 72 h 后在熒光顯微鏡下可見細(xì)胞產(chǎn)生較強(qiáng)的綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率較高，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞狀態(tài)未受影響，結(jié)果如圖 1-2。

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本文編號(hào)：2718256