【摘要】：目的:動脈粥樣硬化(AS)被認為是一種慢性炎癥反應,是由于超過體內正常標準的過高的氧化型的低密度脂蛋白(Ox-LDL)被巨噬細胞攝取后變?yōu)榕菽毎饛娏业腁S效應。本研究利用LDL刺激RAW264.7細胞后,測定細胞中磷脂酶A2(PLA2)的生物活性,利用Real-time PCR和Western bolt技術測定細胞中脂肪酸結合蛋白5(FABP5)和過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)的表達含量,探究它們在轉錄和翻譯水平的變化。同時,利用不飽和脂肪酸(UFAs)包括油酸(OA)、亞油酸(ALA)、花生四烯酸(AA)刺激RAW264.7細胞后測定FABP5的表達水平,旨在探究UFAs與FABP5之間是否存在互相作用關系。利用以上的實驗結果推測PLA2,UFAs,FABP5和PPARs在LDL氧化中的相互作用,為LDL氧化提供新的思路,為臨床疾病的診治指明方向。方法:用LDL刺激RAW264.7細胞不同時間,用PLA2總活性光度法定量檢測試劑盒測定細胞內PLA2活性變化;LDL對RAW264.7細胞進行不同的長時間的刺激后利用Real-time PCR及Western blot技術測定FABP5基因和蛋白變化的水平,利用Real-time PCR技術檢測PPARs的轉錄水平變化;利用梯度離心法把細胞中提取蛋白進行分離后提取脂質筏和非脂質筏對其中的FABP5蛋白含量進行測定,探究FABP5在細胞脂質筏和非脂質筏之間的的轉位;培養(yǎng)RAW264.7細胞,利用UFAs中的不同濃度的OA、ALA、AA刺激后利用Western bolt技術檢測細胞FABP5蛋白表達水平。結果:LDL短時間刺激小鼠RAW264.7細胞后,結果表明PLA2活性升高;LDL刺激RAW264.7細胞較長時間后,FABP5的mRNA和蛋白表達含量均比對照組上升;提取脂質筏后發(fā)現(xiàn),LDL刺激15 min的巨噬細胞的脂筏中FABP5的含量較對照組的升高,而非脂筏部分則出現(xiàn)相反的結果。利用不同濃度的OA,ALA,AA長時間刺激RAW264.7細胞,OA刺激細胞12 h后,FABP5的表達量出現(xiàn)升高的趨勢,ALA刺激細胞5h、12 h后FABP5的表達量均上升,AA刺激細胞后FABP5的表達含量出現(xiàn)升高趨向;對PPARs的研究發(fā)現(xiàn),LDL刺激后,PPAR α無明顯表達,PPAR β和PPARγ的基因表達水平上升。結論:LDL刺激能提高PLA2活性,同時使FABP5表達升高并且發(fā)生了從非脂筏到脂筏的轉位,說明FABP5、PLA2是LDL氧化過程中很重要的因子。UFAs刺激均能使FABP5的表達發(fā)生變化,說明UFAs可能是FABP5在此過程的下游結合分子。LDL刺激后PPARs在細胞內的基因表達水平出現(xiàn)上升的趨勢。結合相關文獻,我們對LDL的氧化過程做出推測:LDL刺激會激活PLA2,而PLA2水解甘油磷脂產(chǎn)生UFAs(OA、ALA、AA等),這些UFAs招募并結合FABP5作為配體與與PPARS特異性位點結合后,然后與目標基因上過氧化物媒體增值因子反應元件PPRE結合,激發(fā)氧化應激通路,促進LDL的氧化,并且這個過程可能與脂質筏相關。
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R543.5
【圖文】：

利用ＰＬＡ２總活性光度法定量檢測試劑盒測定細胞內ＰＬＡ２活性變化：刺激后酶逡逑的活性均增高，刺激７１１１丨１１后酶的活性增高大約兩倍（０．００８６±０．０００３６５），刺激逡逑１５１１１丨１１后酶的活性增高大約１．５倍（０．０００６１士０．０００２８３）（圖１）。逡逑０．０１０－１邋＊逡逑，邐0側－邐＿W逡逑七邋0邋００６－逡逑｜邋０．００４－逡逑ｔ逡逑０－００２－邐Ｍｉ逡逑０邋０００１＾＾逡逑，，，逡逑ｔ／ｍｉｎ逡逑圖１NＤＬ刺激Ｒａｗ２６４．７細胞０邋ｍｉｎ、７邋ｍｉｎ、１５邋ｍｉｎ后ＰＬＡ２活性變化圖逡逑注：與對照組相比，＊ｐ＜０．０５，逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１邋ＰＬＡ２邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ｉｎ邋Ｒａｗ２６４．７邋ｃｅｌｌｓ邋ａｆｔｅｒ邋ｔｈｅ邋ＬＤＬ邋ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ逡逑３．邋２邋ＬＤＬ刺激ＲＡＷ２６４．邋７細胞后ＦＡＢＰ５表達變化以及在脂筏內逡逑的轉位情況逡逑３．邋２．１邋ＬＤＬ刺激ＲＡＷ２６４．邋７細胞后ＦＡＢＰ５表達變化逡逑利用濃度為１００呢／邋ｍＬ的ＬＤＬ誘導ＲＡＷ２６４．７細胞１邋ｈ、３邋ｈ、５邋ｈ后Ｒｅａｌ逡逑ｔｉｍｅ－ＰＣＲ檢測ＦＡＢＰ５ｍＲＮＡ的表達水平（圖２）。與對照組比較，ＬＤＬ刺激逡逑細胞邋ｌｈＦＡＢＰ５ｍＲＮＡ邋表達升高（１．７５２１±０．３１５邋７，Ｐ邋＜邋０．０５）；利用濃度為逡逑１００邋｜ａｇ／ｍＬ的ＬＤＬ刺激細胞１邋ｈ、３邋ｈ、５邋ｈ后，收集細胞利用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｏｌｔ技術逡逑分析細胞內ＦＡＢＰ５表達的情況

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【參考文獻】

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本文編號：2717976