【摘要】：目的:動(dòng)脈粥樣硬化(AS)被認(rèn)為是一種慢性炎癥反應(yīng),是由于超過(guò)體內(nèi)正常標(biāo)準(zhǔn)的過(guò)高的氧化型的低密度脂蛋白(Ox-LDL)被巨噬細(xì)胞攝取后變?yōu)榕菽?xì)胞引起強(qiáng)烈的AS效應(yīng)。本研究利用LDL刺激RAW264.7細(xì)胞后,測(cè)定細(xì)胞中磷脂酶A2(PLA2)的生物活性,利用Real-time PCR和Western bolt技術(shù)測(cè)定細(xì)胞中脂肪酸結(jié)合蛋白5(FABP5)和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)的表達(dá)含量,探究它們?cè)谵D(zhuǎn)錄和翻譯水平的變化。同時(shí),利用不飽和脂肪酸(UFAs)包括油酸(OA)、亞油酸(ALA)、花生四烯酸(AA)刺激RAW264.7細(xì)胞后測(cè)定FABP5的表達(dá)水平,旨在探究UFAs與FABP5之間是否存在互相作用關(guān)系。利用以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)PLA2,UFAs,FABP5和PPARs在LDL氧化中的相互作用,為L(zhǎng)DL氧化提供新的思路,為臨床疾病的診治指明方向。方法:用LDL刺激RAW264.7細(xì)胞不同時(shí)間,用PLA2總活性光度法定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)PLA2活性變化;LDL對(duì)RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行不同的長(zhǎng)時(shí)間的刺激后利用Real-time PCR及Western blot技術(shù)測(cè)定FABP5基因和蛋白變化的水平,利用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)PPARs的轉(zhuǎn)錄水平變化;利用梯度離心法把細(xì)胞中提取蛋白進(jìn)行分離后提取脂質(zhì)筏和非脂質(zhì)筏對(duì)其中的FABP5蛋白含量進(jìn)行測(cè)定,探究FABP5在細(xì)胞脂質(zhì)筏和非脂質(zhì)筏之間的的轉(zhuǎn)位;培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞,利用UFAs中的不同濃度的OA、ALA、AA刺激后利用Western bolt技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞FABP5蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:LDL短時(shí)間刺激小鼠RAW264.7細(xì)胞后,結(jié)果表明PLA2活性升高;LDL刺激RAW264.7細(xì)胞較長(zhǎng)時(shí)間后,FABP5的mRNA和蛋白表達(dá)含量均比對(duì)照組上升;提取脂質(zhì)筏后發(fā)現(xiàn),LDL刺激15 min的巨噬細(xì)胞的脂筏中FABP5的含量較對(duì)照組的升高,而非脂筏部分則出現(xiàn)相反的結(jié)果。利用不同濃度的OA,ALA,AA長(zhǎng)時(shí)間刺激RAW264.7細(xì)胞,OA刺激細(xì)胞12 h后,FABP5的表達(dá)量出現(xiàn)升高的趨勢(shì),ALA刺激細(xì)胞5h、12 h后FABP5的表達(dá)量均上升,AA刺激細(xì)胞后FABP5的表達(dá)含量出現(xiàn)升高趨向;對(duì)PPARs的研究發(fā)現(xiàn),LDL刺激后,PPAR α無(wú)明顯表達(dá),PPAR β和PPARγ的基因表達(dá)水平上升。結(jié)論:LDL刺激能提高PLA2活性,同時(shí)使FABP5表達(dá)升高并且發(fā)生了從非脂筏到脂筏的轉(zhuǎn)位,說(shuō)明FABP5、PLA2是LDL氧化過(guò)程中很重要的因子。UFAs刺激均能使FABP5的表達(dá)發(fā)生變化,說(shuō)明UFAs可能是FABP5在此過(guò)程的下游結(jié)合分子。LDL刺激后PPARs在細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)水平出現(xiàn)上升的趨勢(shì)。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn),我們對(duì)LDL的氧化過(guò)程做出推測(cè):LDL刺激會(huì)激活PLA2,而PLA2水解甘油磷脂產(chǎn)生UFAs(OA、ALA、AA等),這些UFAs招募并結(jié)合FABP5作為配體與與PPARS特異性位點(diǎn)結(jié)合后,然后與目標(biāo)基因上過(guò)氧化物媒體增值因子反應(yīng)元件PPRE結(jié)合,激發(fā)氧化應(yīng)激通路,促進(jìn)LDL的氧化,并且這個(gè)過(guò)程可能與脂質(zhì)筏相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R543.5
【圖文】：

利用ＰＬＡ２總活性光度法定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ＰＬＡ２活性變化：刺激后酶逡逑的活性均增高，刺激７１１１丨１１后酶的活性增高大約兩倍（０．００８６±０．０００３６５），刺激逡逑１５１１１丨１１后酶的活性增高大約１．５倍（０．０００６１士０．０００２８３）（圖１）。逡逑０．０１０－１邋＊逡逑，邐0側(cè)－邐＿W逡逑七邋0邋００６－逡逑｜邋０．００４－逡逑ｔ逡逑０－００２－邐Ｍｉ逡逑０邋０００１＾＾逡逑，，，逡逑ｔ／ｍｉｎ逡逑圖１NＤＬ刺激Ｒａｗ２６４．７細(xì)胞０邋ｍｉｎ、７邋ｍｉｎ、１５邋ｍｉｎ后ＰＬＡ２活性變化圖逡逑注：與對(duì)照組相比，＊ｐ＜０．０５，逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１邋ＰＬＡ２邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ｉｎ邋Ｒａｗ２６４．７邋ｃｅｌｌｓ邋ａｆｔｅｒ邋ｔｈｅ邋ＬＤＬ邋ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ逡逑３．邋２邋ＬＤＬ刺激ＲＡＷ２６４．邋７細(xì)胞后ＦＡＢＰ５表達(dá)變化以及在脂筏內(nèi)逡逑的轉(zhuǎn)位情況逡逑３．邋２．１邋ＬＤＬ刺激ＲＡＷ２６４．邋７細(xì)胞后ＦＡＢＰ５表達(dá)變化逡逑利用濃度為１００呢／邋ｍＬ的ＬＤＬ誘導(dǎo)ＲＡＷ２６４．７細(xì)胞１邋ｈ、３邋ｈ、５邋ｈ后Ｒｅａｌ逡逑ｔｉｍｅ－ＰＣＲ檢測(cè)ＦＡＢＰ５ｍＲＮＡ的表達(dá)水平（圖２）。與對(duì)照組比較，ＬＤＬ刺激逡逑細(xì)胞邋ｌｈＦＡＢＰ５ｍＲＮＡ邋表達(dá)升高（１．７５２１±０．３１５邋７，Ｐ邋＜邋０．０５）；利用濃度為逡逑１００邋｜ａｇ／ｍＬ的ＬＤＬ刺激細(xì)胞１邋ｈ、３邋ｈ、５邋ｈ后，收集細(xì)胞利用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｏｌｔ技術(shù)逡逑分析細(xì)胞內(nèi)ＦＡＢＰ５表達(dá)的情況

３．邋２．１邋ＬＤＬ刺激ＲＡＷ２６４．邋７細(xì)胞后ＦＡＢＰ５表達(dá)變化逡逑利用濃度為１００呢／邋ｍＬ的ＬＤＬ誘導(dǎo)ＲＡＷ２６４．７細(xì)胞１邋ｈ、３邋ｈ、５邋ｈ后Ｒｅａｌ逡逑ｔｉｍｅ－ＰＣＲ檢測(cè)ＦＡＢＰ５ｍＲＮＡ的表達(dá)水平（圖２）。與對(duì)照組比較，ＬＤＬ刺激逡逑細(xì)胞邋ｌｈＦＡＢＰ５ｍＲＮＡ邋表達(dá)升高（１．７５２１±０．３１５邋７，Ｐ邋＜邋０．０５）；利用濃度為逡逑１００邋｜ａｇ／ｍＬ的ＬＤＬ刺激細(xì)胞１邋ｈ、３邋ｈ、５邋ｈ后，收集細(xì)胞利用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｏｌｔ技術(shù)逡逑分析細(xì)胞內(nèi)ＦＡＢＰ５表達(dá)的情況，數(shù)據(jù)表明：刺激細(xì)胞１邋ｈ后ＦＡＢＰ５的表達(dá)量上逡逑２３逡逑

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 王春陽(yáng);;氧化型低密度脂蛋白與動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展[J];中西醫(yī)結(jié)合心血管病電子雜志;2017年29期

2 郭建恩;米樹(shù)斌;閆秀川;辛思源;高飛;梁廣和;李靜華;;瓜蔞薤白半夏湯對(duì)ApoE小鼠血脂代謝、氧化應(yīng)激和主動(dòng)脈Lox-1表達(dá)的影響[J];中國(guó)中藥雜志;2017年04期

3 許冰冰;葉云;高曉燕;宋健;趙瑾超;王貴玲;武軍駐;;低密度脂蛋白誘導(dǎo)Raw264.7巨噬細(xì)胞后脂質(zhì)筏中脂類物質(zhì)組分的變化[J];免疫學(xué)雜志;2016年03期

4 Kazim Husain;Wilfredo Hernandez;Rais A Ansari;Leon Ferder;;Inflammation, oxidative stress and renin angiotensin system in atherosclerosis[J];World Journal of Biological Chemistry;2015年03期

5 秦錦標(biāo);;血管緊張素轉(zhuǎn)化酶、血管緊張素與認(rèn)知[J];醫(yī)學(xué)綜述;2009年08期

本文編號(hào)：2717976