【摘要】：目的探討CD137-CD137L信號(hào)是否通過(guò)Rab7分子調(diào)控自噬影響小鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)外泌體的分泌。方法采用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)小鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞,取分離培養(yǎng)的第3-5代VSMC進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為四組:對(duì)照組;CD137激動(dòng)組(CD137L重組蛋白10μg/ml,激動(dòng)CD137信號(hào));慢病毒對(duì)照組(對(duì)照干擾慢病毒干預(yù)+CD137L重組蛋白);Rab7慢病毒干擾組(Rab7干擾慢病毒干預(yù)+CD137L重組蛋白)。采用Western Blot法檢測(cè)各組VSMC微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3Ⅱ)、p62及Rab7蛋白的表達(dá)。熒光顯微鏡觀察自噬雙標(biāo)腺病毒(mRFP-GFP-LC3)感染后自噬流變化。透射電鏡觀察VSMC來(lái)源外泌體的形態(tài)及大小,Western Blot法檢測(cè)CD9、CD81及Hsc70外泌體相關(guān)標(biāo)記物和自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ的表達(dá)。NTA(Nanoparticle Tracking Analysis)技術(shù)檢測(cè)各組外泌體濃度及粒徑大小。結(jié)果(1)在透射電子顯微鏡下,小鼠VSMC來(lái)源的囊泡狀結(jié)構(gòu)大小約30-150nm,Western Blot顯示囊泡外泌體標(biāo)記物CD9、CD81的高表達(dá)。(2)CD137激動(dòng)組VSMC中Rab7、LC3Ⅱ和p62蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P0.05)。Rab7慢病毒干擾組Rab7、LC3Ⅱ和p62蛋白表達(dá)低于CD137激動(dòng)組(P0.05)。慢病毒對(duì)照組與CD137激動(dòng)組無(wú)差異(P0.05)。(3)各組VSMC自噬流顯示:CD137激動(dòng)組VSMC內(nèi)熒光斑點(diǎn)總數(shù)和黃色熒光點(diǎn)數(shù)均多于對(duì)照組(P0.05),且CD137激動(dòng)組VSMC內(nèi)黃色熒光點(diǎn)數(shù)多于紅色。而Rab7慢病毒干擾組VSMC內(nèi)熒光斑點(diǎn)總數(shù)和黃色熒光點(diǎn)數(shù)均少于CD137激動(dòng)組(P0.05),且Rab7慢病毒干擾組VSMC內(nèi)紅色熒光斑點(diǎn)數(shù)多于黃色。慢病毒對(duì)照組與CD137激動(dòng)組無(wú)差異(P0.05)。(4)各組VSMC培養(yǎng)基中外泌體的分泌水平顯示:CD137激動(dòng)組細(xì)胞分泌的粒子數(shù)明顯高于對(duì)照組(P0.05);Rab7慢病毒干擾組細(xì)胞分泌的粒子數(shù)明顯低于CD137激動(dòng)組(P0.05)。CD137激動(dòng)組細(xì)胞分泌的外泌體中Hsc70蛋白表達(dá)高于對(duì)照組(P0.05);Rab7慢病毒干擾組細(xì)胞分泌的外泌體中Hsc70蛋白表達(dá)低于CD137激動(dòng)組(P0.05)。慢病毒對(duì)照組與CD137激動(dòng)組無(wú)差異(P0.05)。(5)各組VSMC培養(yǎng)基中外泌體的自噬相關(guān)蛋白表達(dá):各組外泌體中可以檢測(cè)到Lc3Ⅱ蛋白的表達(dá),且CD137激動(dòng)組外泌體Lc3Ⅱ蛋白表達(dá)高于對(duì)照組(P0.05),Rab7慢病毒干擾組外泌體LC3Ⅱ蛋白表達(dá)低于CD137激動(dòng)組(P0.05),慢病毒對(duì)照組外泌體LC3Ⅱ蛋白表達(dá)與CD137激動(dòng)組無(wú)差異(P0.05)。結(jié)論CD137信號(hào)可能通過(guò)Rab7調(diào)控自噬影響小鼠血管平滑肌細(xì)胞外泌體的分泌。
【圖文】：

CD137-CD137L 信號(hào)通過(guò) Rab7 調(diào)控自噬對(duì)小鼠血管平滑肌細(xì)胞外泌體分泌的影響進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)和多組間的方差分析，隨后采用 LSD 進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。以 P< 0.05 代表有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少三次，取其平均數(shù)通過(guò) Graphpad 制圖。2.3 結(jié)果2.3.1 小鼠原代主動(dòng)脈 VSMCs 的觀察及鑒定組織塊貼壁后培養(yǎng) 3-4 天，可見(jiàn)組織塊周圍出現(xiàn)大小及形態(tài)不同的細(xì)胞，，如三角形、梭形及方形等。細(xì)胞生長(zhǎng)起初非常緩慢，在經(jīng)過(guò)多次傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)速度較前明顯增加，部分細(xì)胞區(qū)域可見(jiàn)山峰和山谷，即典型的峰谷樣生長(zhǎng)。原代平滑肌細(xì)胞傳至第三代以后，可以使用 α-SMA-actin 抗體進(jìn)行免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下，細(xì)胞質(zhì)可見(jiàn)綠色放射樣束狀熒光即為平滑肌肌動(dòng)蛋白，藍(lán)色為經(jīng)過(guò)DAPI 染色的胞核。如圖所示：α-SMA 的陽(yáng)性表達(dá)在 90%以上。（圖 2.3.1）

圖 2.3.2.小鼠血管平滑肌細(xì)胞來(lái)源的外泌體的鑒定。（圖中 1、2 均為未予處理的小鼠血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基中的外泌體）。圖左為電鏡下 VSMC 來(lái)源的外泌體的形態(tài)（白色箭頭所指）；圖右為外泌體標(biāo)記物 CD9、CD81 蛋白表達(dá)。Figure 2.3.2. Identification of exosomes derived from mouse vascular smooth muscle cells.2.3.3 Rab7 慢病毒敲低效率小鼠 VSMCs 細(xì)胞分為兩組：對(duì)照組；Rab7 敲低組（加入 Rab7 干擾慢病毒，終濃度 6μg/ml，干擾 Rab7 的表達(dá)）。如圖 Western blot 所示：Rab7 敲低組 VSMC 中 Rab7蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組（0.17±0.02 比 0.95±0.02，P<0.01）。（圖 2.3.3）
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R543.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 許堯;陳蕊;丁亮;仲威;楊萍;李波;邵晨;王中群;嚴(yán)金川;;CD137-CD137配體信號(hào)通路通過(guò)JNK途徑影響小鼠血管平滑肌細(xì)胞自噬[J];中華心血管病雜志;2018年05期

本文編號(hào)：2709537