【摘要】：目的探討CD137-CD137L信號是否通過Rab7分子調(diào)控自噬影響小鼠血管平滑肌細胞(VSMC)外泌體的分泌。方法采用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)小鼠胸主動脈平滑肌細胞,取分離培養(yǎng)的第3-5代VSMC進行實驗。實驗分為四組:對照組;CD137激動組(CD137L重組蛋白10μg/ml,激動CD137信號);慢病毒對照組(對照干擾慢病毒干預+CD137L重組蛋白);Rab7慢病毒干擾組(Rab7干擾慢病毒干預+CD137L重組蛋白)。采用Western Blot法檢測各組VSMC微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3Ⅱ)、p62及Rab7蛋白的表達。熒光顯微鏡觀察自噬雙標腺病毒(mRFP-GFP-LC3)感染后自噬流變化。透射電鏡觀察VSMC來源外泌體的形態(tài)及大小,Western Blot法檢測CD9、CD81及Hsc70外泌體相關(guān)標記物和自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ的表達。NTA(Nanoparticle Tracking Analysis)技術(shù)檢測各組外泌體濃度及粒徑大小。結(jié)果(1)在透射電子顯微鏡下,小鼠VSMC來源的囊泡狀結(jié)構(gòu)大小約30-150nm,Western Blot顯示囊泡外泌體標記物CD9、CD81的高表達。(2)CD137激動組VSMC中Rab7、LC3Ⅱ和p62蛋白表達明顯高于對照組(P0.05)。Rab7慢病毒干擾組Rab7、LC3Ⅱ和p62蛋白表達低于CD137激動組(P0.05)。慢病毒對照組與CD137激動組無差異(P0.05)。(3)各組VSMC自噬流顯示:CD137激動組VSMC內(nèi)熒光斑點總數(shù)和黃色熒光點數(shù)均多于對照組(P0.05),且CD137激動組VSMC內(nèi)黃色熒光點數(shù)多于紅色。而Rab7慢病毒干擾組VSMC內(nèi)熒光斑點總數(shù)和黃色熒光點數(shù)均少于CD137激動組(P0.05),且Rab7慢病毒干擾組VSMC內(nèi)紅色熒光斑點數(shù)多于黃色。慢病毒對照組與CD137激動組無差異(P0.05)。(4)各組VSMC培養(yǎng)基中外泌體的分泌水平顯示:CD137激動組細胞分泌的粒子數(shù)明顯高于對照組(P0.05);Rab7慢病毒干擾組細胞分泌的粒子數(shù)明顯低于CD137激動組(P0.05)。CD137激動組細胞分泌的外泌體中Hsc70蛋白表達高于對照組(P0.05);Rab7慢病毒干擾組細胞分泌的外泌體中Hsc70蛋白表達低于CD137激動組(P0.05)。慢病毒對照組與CD137激動組無差異(P0.05)。(5)各組VSMC培養(yǎng)基中外泌體的自噬相關(guān)蛋白表達:各組外泌體中可以檢測到Lc3Ⅱ蛋白的表達,且CD137激動組外泌體Lc3Ⅱ蛋白表達高于對照組(P0.05),Rab7慢病毒干擾組外泌體LC3Ⅱ蛋白表達低于CD137激動組(P0.05),慢病毒對照組外泌體LC3Ⅱ蛋白表達與CD137激動組無差異(P0.05)。結(jié)論CD137信號可能通過Rab7調(diào)控自噬影響小鼠血管平滑肌細胞外泌體的分泌。
【圖文】：

CD137-CD137L 信號通過 Rab7 調(diào)控自噬對小鼠血管平滑肌細胞外泌體分泌的影響進行方差齊性檢驗和多組間的方差分析，隨后采用 LSD 進行顯著性檢驗。以 P< 0.05 代表有統(tǒng)計學意義。所有實驗重復至少三次，取其平均數(shù)通過 Graphpad 制圖。2.3 結(jié)果2.3.1 小鼠原代主動脈 VSMCs 的觀察及鑒定組織塊貼壁后培養(yǎng) 3-4 天，可見組織塊周圍出現(xiàn)大小及形態(tài)不同的細胞，，如三角形、梭形及方形等。細胞生長起初非常緩慢，在經(jīng)過多次傳代后細胞生長速度較前明顯增加，部分細胞區(qū)域可見山峰和山谷，即典型的峰谷樣生長。原代平滑肌細胞傳至第三代以后，可以使用 α-SMA-actin 抗體進行免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下，細胞質(zhì)可見綠色放射樣束狀熒光即為平滑肌肌動蛋白，藍色為經(jīng)過DAPI 染色的胞核。如圖所示：α-SMA 的陽性表達在 90%以上。（圖 2.3.1）

圖 2.3.2.小鼠血管平滑肌細胞來源的外泌體的鑒定。（圖中 1、2 均為未予處理的小鼠血管平滑肌細胞培養(yǎng)基中的外泌體）。圖左為電鏡下 VSMC 來源的外泌體的形態(tài)（白色箭頭所指）；圖右為外泌體標記物 CD9、CD81 蛋白表達。Figure 2.3.2. Identification of exosomes derived from mouse vascular smooth muscle cells.2.3.3 Rab7 慢病毒敲低效率小鼠 VSMCs 細胞分為兩組：對照組；Rab7 敲低組（加入 Rab7 干擾慢病毒，終濃度 6μg/ml，干擾 Rab7 的表達）。如圖 Western blot 所示：Rab7 敲低組 VSMC 中 Rab7蛋白表達明顯低于對照組（0.17±0.02 比 0.95±0.02，P<0.01）。（圖 2.3.3）
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R543.5

【參考文獻】

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1 許堯;陳蕊;丁亮;仲威;楊萍;李波;邵晨;王中群;嚴金川;;CD137-CD137配體信號通路通過JNK途徑影響小鼠血管平滑肌細胞自噬[J];中華心血管病雜志;2018年05期

本文編號：2709537