【摘要】：動脈粥樣硬化(Atherosclerosis)目前被大多數(shù)學(xué)者認為屬于一種脂質(zhì)代謝障礙相關(guān)的慢性炎癥性血管病變,是導(dǎo)致臨床中急性心肌梗死、腦梗死等血管阻塞性疾病的最主要病理生理基礎(chǔ)之一。目前對于動脈粥樣硬化斑塊形成機制的認識基礎(chǔ)是脂質(zhì)沉積學(xué)說。參與病變血管動脈斑塊形成的細胞,既包括原位血管的細胞,如內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞以及脂肪細胞,還包括血管外細胞,如單核-巨噬細胞、淋巴細胞及嗜堿性粒細胞等。目前已有研究證據(jù)提示這些非血管原位細胞,如單核-巨噬細胞,在動脈斑塊中進展中起著至關(guān)重要的作用。Ⅰ型成纖維細胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor-1,FGFR1)屬于FGFR家族一員,通過與成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factors,FGFs)相互作用后二聚化,發(fā)生磷酸化激活后,通過細胞生物信號的級聯(lián)反應(yīng),激活成纖維生長因子受體底物(FGF receptor substrate 2,FRS2),進而調(diào)控細胞中核心信號蛋白,如磷酸脂酶Cγ(phospholipase Cγ,PLCγ)等,影響著機體的生長發(fā)育、細胞增殖與存活、代謝調(diào)控等多方面的生長狀態(tài)。目前為止,FGFR1的相互作用配體除最經(jīng)典的FGFs,還有后來被發(fā)現(xiàn)的其他多種非經(jīng)典配體,例如有神經(jīng)細胞黏附分子、硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPGs)及肝素等。臨床研究發(fā)現(xiàn)多種癌癥發(fā)生中伴隨著腫瘤組織內(nèi)FGFR1過表達或突變激活,從而促進腫瘤血管形成和腫瘤快速發(fā)展;因此,FGFR1也被廣泛認為是一類重要抗腫瘤藥物靶標(biāo),目前已有三個FGFR1小分子抑制劑進入抗腫瘤2期臨床試驗階段。近年來,FGFR1在非腫瘤疾病的研究進展陸續(xù)受到關(guān)注。值的注意的是,FGFR1在動脈粥樣硬化性疾病中的具體作用以及作用機制,卻鮮有報道。但是,近期研究結(jié)果提示,FGFR1很可能也是動脈粥樣硬化的潛在調(diào)控位點。在小鼠動脈粥樣硬化模型中FGFR1被發(fā)現(xiàn)高表達于病變血管;進一步研究發(fā)現(xiàn),FGFR1特異性抑制劑SU5402干預(yù)經(jīng)典的動脈粥樣硬化動物模型(載脂蛋白E敲除小鼠,ApoE-/-小鼠),動脈斑塊的進展得到控制。在本研究中,我們通過構(gòu)建在體ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型和離體的巨噬細胞泡沫化模型,嘗試研究FGFR1在動脈粥樣硬化形成的作用,并探討可能的信號傳導(dǎo)通路。本研究將分三部分內(nèi)容從不同角度進行闡述。第一部分動脈粥樣硬化中FGFR1異常表達目的:明確FGFR1在動脈粥樣硬化中FGFR1的表達及分布。方法:通過高脂飲食(high fat diet,HFD)誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠形成動脈粥樣硬化模型,以低脂飲食(low fat diet,LFD)喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠作為對照。相應(yīng)飲食喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠16周后處死后取主動脈,運用Western Blot和免疫組化方法檢測小鼠動脈p-FGFR 1和FGFR1的蛋白水平;利用組織動脈冰凍切片做FGFR1與CD31/CD68/α-SMA的熒光雙染觀察FGFR1在各細胞中的表達水平;采用密度梯度離心法從動脈粥樣硬化患者和正常人群的外周血獲取單個核細胞,分別提取mRNA與總蛋白,實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測FGFR1的mRNA水平,Western Blot檢測細胞FGFR1的蛋白水平。結(jié)果:Western Blot實驗提示相較于LFD小鼠,HFD組ApoE-/-小鼠主動脈中FGFR1磷酸化激活水平明顯升高;組織免疫熒光實驗也提示HFD組ApoE-/-小鼠的動脈粥樣硬化血管中高表達FGFR1的巨噬細胞的細胞百分比顯著升高;高表達FGFR1的內(nèi)皮細胞數(shù)量顯著下降;高表達FGFR1的平滑肌細胞數(shù)目在兩組間無明顯差異。此外,動脈粥樣硬化患者的單個核細胞中FGFR1蛋白和mRNA水平相較于正常人群均顯著升高。結(jié)論:動脈粥樣硬化病變血管及外周單個核細胞中FGFR1激活水平顯著提高,并且巨噬細胞FGFR1的高表達可能和動脈粥樣硬化的病理生理過程相關(guān)。第二部分 FGFR1抑制劑有效緩解高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的發(fā)展目的:觀察FGFR1抑制劑對高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的發(fā)展的影響。方法:借助高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠構(gòu)建血管粥樣硬化模型,并給予一定劑量(10mg/kg/天或20mg/kg/天,隔天一次)的FGFR1抑制劑AZD4547灌胃治療,16周后處死小鼠取主動脈,運用油紅O染色法檢測小鼠胸腹主動脈動脈整體斑塊形成情況;運用免疫組化方法和RT-PCR檢測小鼠動脈脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白(CD36)的蛋白表達和mRNA水平;通過RT-PCR檢測小鼠動脈中白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)在轉(zhuǎn)錄水平的變化;通過免疫組化檢測小鼠主動脈中IL-6、TNF-α和CD68表達水平,評估血管炎癥和巨噬細胞浸潤水平;利用二氫乙啶(DHE)染色與3-硝基酪氨酸(3-NT)免疫組化染色觀察小鼠動脈氧化應(yīng)激水平。結(jié)果:與單純高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠,高脂喂養(yǎng)的同時接受FGFR1抑制劑AZD4547干預(yù)的ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊面積減少,血管CD36和CD68表達降低,炎癥因子表達減少,動脈氧化應(yīng)激水平減輕。結(jié)論:FGFR1抑制劑AZD4547可降低炎癥與氧化反應(yīng),并顯著緩解高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化發(fā)展,說明了 FGFR1可能通過介導(dǎo)炎癥與氧化應(yīng)激調(diào)控動脈粥樣硬化病程的發(fā)生與發(fā)展。第三部分FGFR1在巨噬細胞中的作用及機制研究目的:觀察FGFR1在巨噬細胞中的作用和機制探討。方法:提取原代巨噬細胞(MPM)并培養(yǎng),利用FGFR1抑制劑AZD4547預(yù)處理,ox-LDL刺激15分鐘后,裂解細胞并提取總蛋白,Western Blot檢測p-FGFR1、FGFR1的表達;siRNA干預(yù)沉默凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體(Lectin Like Oxidized Low Density Lipoprotein Receptor 1,Lox-1),ox-LDL 刺激 15 分鐘后,裂解細胞并提取總蛋白,檢測p-FGFR1、FGFR1的表達;ox-LDL刺激24小時后,運用油紅O染色法檢測細胞脂質(zhì)堆積程度;運用免疫熒光方法、細胞流式檢查和Western Blot檢測巨噬細胞的CD36表達;siRNA干預(yù)沉默F(xiàn)RS2和PLCy或通過過氧化物酶體增殖物激活受體 γ(peroxisome proliferator-activated receptor,PPARy)激動劑羅格列酮和抑制劑GW9662調(diào)控PPARγ激活水平,隨后ox-LDL刺激巨噬細胞,免疫熒光方法檢測脂質(zhì)堆積,RT-PCR和ELISA檢測細胞炎癥因子(IL-6和TNF-α)的mRNA和蛋白分泌水平,二氫乙錠(DHE)和2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCF-DA)染色法檢測巨噬細胞炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激。結(jié)果:ox-LDL干預(yù)可誘導(dǎo)巨噬細胞FGFR1的磷酸化激活及脂質(zhì)堆積;FGFR1抑制劑AZD4547預(yù)處理后,ox-LDL對巨噬細胞FGFR1的磷酸化降低;siRNA抑制Lox1表達后,ox-LDL對FGFR1的磷酸化作用被阻斷。通過siRNA抑制CD36表達或用AZD4547干預(yù)后,結(jié)果顯示巨噬細胞脂質(zhì)堆積程度降低。通過siRNA抑制FRS2、PLCy和用PPARy的激動劑和抑制劑預(yù)處理后,結(jié)果顯示抑制PPARy可降低巨噬細胞脂質(zhì)堆積。通過siRNA抑制PLCγ、FRS2、PPARy和用PPARy的激動劑和抑制劑預(yù)處理后,結(jié)果顯示抑制PLCγ可有效降低細胞炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激。結(jié)論:FGFR1抑制劑AZD4547可降低巨噬細胞的細胞炎癥、氧化反應(yīng)與脂質(zhì)堆積,并且FGFR1可能通過PLCγ介導(dǎo)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細胞的炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激,并通過PPARγ/CD36介導(dǎo)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細胞的脂質(zhì)堆積。
【圖文】：

ｍｇ／ｄｌ）和甘油三醋（１２１．９±１８．４邋ｖｓ邋５８．４±８．４邋ｍｇ／ｄｌ）水平明顯升高。Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ逡逑顯示ＨＦＤ喂養(yǎng)的ＡｐｏＥｖ—小鼠主動脈ＦＧＦＲ１磷酸化的水平較ＬＦＤ喂養(yǎng)的小鼠增加逡逑（圖１Ａ）。免疫組織化學(xué)實驗檢測主動脈組織ＦＧＦＲ１磷酸化水平也進一步證實了逡逑這一結(jié)果（圖１Ｂ）。這些結(jié)果顯示小鼠動脈粥樣硬化血管中ＦＧＦＲ１磷酸化和活性逡逑增加。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑ＡｐｏＥ－／－邋ＬＦ邐ＡｐｏＥ＾ＨＦ邐ＡｐｏＥ邋ｙ－ＬＦ邋ＡｐｄＥ邋ＨＦ逡逑Ｐ－ＦＧＦＲ１邐ＨＰ邐％逡逑ｆｇｆｒｉ邋ｍｍｍ邐之逡逑Ｔ－逡逑ａ：邐Ｑ逡逑＝￥邐ｍ邋８１邐＃＃＃逡逑ｃｒ邐＃＃邐［２邐—ｒ－逡逑１．２－邐Ｈ逡逑ｆｊｎ邋＿邋ｒｌａ＿Ｂ＿逡逑ＡｐｏＥ／＿ＬＦ邋ＡｐｏＥ－＂ＨＦ邐ＡｐｏＥ邋１邋ＬＦ邋ＡｐｏＥ＇邋ＨＦ逡逑圖１邋ＨＦＤ喂養(yǎng)的ＡｐｏＥ—ｚ？小鼠動脈中的ＦＧＦＲＩ顯著激活。逡逑Ａ．

邋ＣＤ３１和ａ－ＳＭＡ作為巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞的標(biāo)記蛋逡逑白做雙重免疫熒光染色，并用ＤＡＰＩ顯示細胞核。染色結(jié)果顯示，相比于對照組，逡逑ＦＧＦＲ１與ＣＤ６８在高脂組小鼠血管中高表達，且在表徸分布上具有相似性（圖２）；逡逑相較與對照組，高脂組小鼠血管ＣＤ３１陽性細胞中表達ＦＧＦＲ１的細胞比例有所降逡逑低（圖３）；此外，ａ－ＳＭＡ表達陽性細胞中表徸ＦＧＦＲ１的細胞比例在高脂組和對逡逑照組血管中未出現(xiàn)明顯差異（圖４）。這說明了在Ａｐ0Ｅ＿Ａ小鼠中，高脂飲食誘導(dǎo)了逡逑巨噬細胞中ＦＧＦＲ１表達，而不是在血管內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞。逡逑１３逡逑
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R543.5

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本文編號：2709508