【摘要】：目的:研究替普瑞酮(Geranylgeranylacetone,GGA)在動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)中的作用及機(jī)制,并探討熱休克蛋白22(heat shock protein22,HSP22)在其中的作用。方法:細(xì)胞部分:1、篩選GGA對(duì)人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human coronary artery endothelial cells,HCAECs)的最適作用濃度;2、將狀態(tài)良好的HCAECs,傳代后培養(yǎng)24h,分為4組,分別為對(duì)照組、GGA處理組、HSP22干擾組和HSP22干擾+GGA組,轉(zhuǎn)染24h后,加用GGA干預(yù),無水乙醇作為對(duì)照,處理12h后,再予ox-LDL處理24h;3、流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)細(xì)胞凋亡,檢測(cè)活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平,RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞HSP22、NF-κB mRNA水平,Western Blot檢測(cè)HSP22、核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)及細(xì)胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)的表達(dá);動(dòng)物部分:1、選取周齡為8-9周,基因型分別為ApoE~(-/-)(HSP22野生型)、HSP22~(-/-)//ApoE~(-/)(HSP22敲除型)雄性小鼠各16只,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,各分為2亞組,共4組,分別為野生HSP22組(wildtype groups,WT組)、野生HSP22+GGA處理組(wildtype+GGA groups,WT+GGA組),HSP22基因敲除組(HSP22 knockout group,KO組)與HSP22基因敲除+GGA處理組(HSP22knockout+GGA group,KO+GGA組),高脂喂養(yǎng)12周,其中GGA處理組和KO+GGA組從第5周始,予GGA(400mg/(kg·d))灌胃,其余各組灌予等量生理鹽水作為對(duì)照,共處理8周;2、每周測(cè)小鼠體重,分別在干預(yù)前后檢測(cè)小鼠血脂水平,ELISA檢測(cè)血清HSP22濃度;3、主動(dòng)脈整體油紅O染色,主動(dòng)脈弓及根部HE染色;4、Western Blot檢測(cè)主動(dòng)脈HSP22、NF-κB、eNOS及ICAM-1蛋白的表達(dá)。結(jié)果:1、GGA的最適作用濃度為1.0μmol/L;2、流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)(1)細(xì)胞凋亡:對(duì)照組vs GGA組(31.78±3.27 vs 23.99±2.03,P0.05),GGA組細(xì)胞凋亡降低;對(duì)照組vs HSP22干擾組(31.78±3.27 vs 35.92±4.47,P0.05),細(xì)胞凋亡無明顯變化;GGA組vs HSP22干擾+GGA組(23.99±2.03 vs33.24±4.85,P0.05),HSP22干擾+GGA組,細(xì)胞凋亡增加;HSP22干擾組vs HSP22干擾+GGA組(35.92±4.47 vs 33.24±4.85,P0.05),兩組無明顯差異;(2)ROS水平:對(duì)照組vs GGA組(308.0±23.52 vs 218.0±26.21,P0.05),GGA組ROS水平顯著下降;對(duì)照組vs HSP22干擾組(308.0±23.52 vs 422.7±41.26P0.05),HSP22干擾組ROS水平顯著上升;GGA組vs HSP22干擾+GGA組(218.0±26.21 vs 381.7±56.22,P0.05),HSP22干擾+GGA組ROS水平明顯升高;比較HSP22干擾組和HSP22干擾+GGA處理組(422.7±41.26 vs 381.7±56.22,P0.05),兩組ROS水平無明顯差異。3、RT-qPCR(1)細(xì)胞HSP22 m RNA的相對(duì)表達(dá)量:與對(duì)照組相比,GGA組HSP22mRNA的相對(duì)表達(dá)量為1.85±0.189(P0.05),顯著升高;HSP22干擾組和HSP22干擾+GGA組,HSP22 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均很低,且無明顯差異(0.30±0.281vs 0.25±0.215,P0.05);(2)細(xì)胞NF-κB m RNA的相對(duì)表達(dá)量:與對(duì)照組相比,GGA組NF-κB mRNA的相對(duì)表達(dá)量為0.68±0.052(P0.05),有所降低,HSP22干擾組NF-κB mRNA的相對(duì)表達(dá)量為1.43±0.160(P0.05),明顯升高;GGA組vs HSP22干擾+GGA組(0.68±0.052 vs 1.31±0.327,P0.05),HSP22干擾+GGA組明顯升高;HSP22干擾組vs HSP22干擾+GGA組,兩組無明顯差異(1.43±0.160 vs1.31±0.327,P0.05)。4、Western Blot檢測(cè)HSP22、NF-κB、ICAM-1及eNOS的表達(dá):(1)HSP22的表達(dá):對(duì)照組vs GGA組(0.231±0.025 vs 0.364±0.058,P0.05),GGA組明顯升高;HSP22干擾組和HSP22干擾+GGA組,HSP22的表達(dá)水平均很低,且無明顯差異(0.090±0.015 vs 0.089±0.016,P0.05);(2)NF-κB的表達(dá):對(duì)照組vs GGA組(0.781±0.092 vs 0.595±0.068,P0.05),GGA組有所下降;對(duì)照組vs HSP22干擾組(0.781±0.092 vs 1.042±0.102,P0.05),HSP22干擾組有所增加;GGA組vs HSP22干擾+GGA組(0.595±0.068 vs0.805±0.090,P0.05),HSP22干擾+GGA組顯著升高;HSP22干擾組vs HSP22干擾+GGA組(1.042±0.102 vs 0.805±0.090,P0.05),HSP22干擾+GGA組有所下降;(3)ICAM-1的表達(dá):對(duì)照組vs GGA組(0.447±0.061 vs 0.305±0.064,P0.05),GGA組有所下降;對(duì)照組vs HSP22干擾組(0.447±0.061 vs 0.589±0.045,P0.05),HSP22干擾組有所增加;GGA組vs HSP22干擾+GGA組(0.305±0.064vs 0.571±0.127,P0.05),HSP22干擾+GGA組顯著升高;HSP22干擾組vs HSP22干擾+GGA組,兩組無明顯差異(0.589±0.045 vs 0.571±0.127,P0.05);(4)eNOS的表達(dá):對(duì)照組vs GGA組,兩組無明顯差異(0.438±0.053 vs0.556±0.065,P0.05);對(duì)照組vs HSP22干擾組,兩組亦無顯著差異(0.438±0.053vs 0.381±0.092,P0.05);GGA組vs HSP22干擾+GGA組(0.556±0.065 vs0.406±0.048,P0.05),HSP22干擾+GGA組有所降低;HSP22干擾組vs HSP22干擾+GGA組,兩組無明顯差異(0.381±0.092 vs 0.406±0.048,P0.05)。5、血脂水平(1)基線水平:比較各組小鼠基線血脂水平,均無明顯差異(P0.05);(2)干預(yù)后水平:各組小鼠血清總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)及高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)均無明顯差異(P0.05)。6、ELISA檢測(cè)血清HSP22濃度:(1)干預(yù)前:WT組和WT+GGA組,小鼠血清HSP22的水平無明顯差異(68.30±7.92 vs 70.77±7.78,P0.05),KO組及KO+GGA組小鼠血清中HSP22幾乎檢測(cè)不到,且無明顯差異(17.53±3.01 vs 20.03±2.19,P0.05);(2)干預(yù)后:WT組vs WT+GGA組(192.3±25.69 vs 273.1±24.13,P0.05),WT+GGA組小鼠血清中HSP22的水平顯著升高;KO組及KO+GGA組小鼠血清中HSP22仍然很低,且無明顯差異(34.27±5.78 vs 36.53±6.11,P0.05)。7、組織病理學(xué)觀察主動(dòng)脈整體油紅O染色計(jì)算小鼠主動(dòng)脈斑塊相對(duì)面積:WT組vs WT+GGA組(12.42±1.49 vs 6.82±0.83,P0.01),WT+GGA組明顯減少;WT組vs KO組,兩組無明顯差異(12.42±1.49 vs 13.70±0.86,P0.05);WT+GGA組vs KO+GAA組,兩組無明顯差異(6.82±0.83 vs 7.16±2.29,P0.05);KO組vs KO+GGA組(13.70±0.86 vs 7.16±2.29,P0.01),KO+GGA組顯著減少。主動(dòng)脈根部HE染色計(jì)算小鼠主動(dòng)脈根部斑塊相對(duì)面積:WT組vs WT+GGA組(41.80±3.05vs 29.21±5.46,P0.05),WT+GGA組明顯減少;WT組vs KO組(41.81±3.05 vs 48.24±2.40,P0.05),KO組有所增加;WT+GGA組vs KO+GGA組(29.21±5.46vs 35.82±3.67,P0.05),兩組無明顯差異;KO組vs KO+GGA組(48.24±2.40 vs 35.82±3.67,P0.05),KO+GGA組顯著減少。8、Western Blot檢測(cè)主動(dòng)脈HSP22、NF-κB、ICAM-1及eNOS的表達(dá):(1)HSP22的表達(dá):WT組vs WT+GGA組(0.297±0.090 vs 0.593±0.080,P0.05),WT+GGA組表達(dá)增加;KO組和KO+GGA組看不到HSP22的條帶,且無明顯差異(0.057±0.021 vs 0.050±0.010,P0.05);(2)NF-κB的表達(dá):WT組vs WT+GGA組(0.630±0.070 vs 0.357±0.090,P0.05),WT+GGA組有所降低;WT組vs KO組(0.630±0.070 vs 1.117±0.175,P0.05),KO組明顯增加;WT+GGA組vs KO+GGA組(0.357±0.090 vs0.703±0.133,P0.05),KO+GGA組明顯增加;KO組vs KO+GGA組(1.117±0.175vs 0.703±0.133,P0.05),KO+GGA組有所下降;(3)ICAM-1的表達(dá):WT組vs WT+GGA組(0.183±0.031 vs 0.113±0.031,P0.05),WT+GGA組有所下降;WT組vs KO組(0.183±0.031 vs 0.327±0.080,P0.05),KO組顯著升高;WT+GGA組vs KO+GGA組(0.113±0.031 vs 0.297±0.090,P0.05),KO+GGA組明顯增加;KO組vs KO+GGA組,兩組無明顯差異(0.327±0.080 vs 0.297±0.090,P0.05);(4)eNOS的表達(dá):WT組vs WT+GGA組,兩組無明顯差異(0.263±0.040vs 0.277±0.040,P0.05);WT組vs KO組(0.263±0.04 vs 0.160±0.046,P0.05),KO組有所下降;WT+GGA組vs KO+GGA組(0.277±0.040 vs 0.173±0.031,P0.05),KO+GGA組有所下降;KO組vs KO+GGA組,兩組無明顯差異(0.160±0.046 vs 0.173±0.031,P0.05)。結(jié)論:1、GGA能誘導(dǎo)HCAECs表達(dá)HSP22,且GGA對(duì)HSP22的誘導(dǎo)作用呈劑量依賴的關(guān)系;2、適當(dāng)濃度的GGA可減少ox-LDL誘導(dǎo)的HCAECs凋亡,其主要機(jī)制為GGA誘導(dǎo)HSP22表達(dá),進(jìn)而下調(diào)NF-κB、ICAM-1;3、GGA能通過誘導(dǎo)HSP22表達(dá),下調(diào)NF-κB、ICAM-1,減輕炎癥反應(yīng),同時(shí)還能抑制粥樣斑塊形成,減少斑塊面積,在AS的形成及進(jìn)展中均發(fā)揮保護(hù)作用。
【圖文】：

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡（n=3）（注：A、B、C、D、E、F 依次表示，濃度分別為 0μmol/L、0.01μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L、10μmol/L、100μmol/L 的 GGA 預(yù)處理后，再加 ox-LDL 處理，，細(xì)胞凋亡的情況）

細(xì)胞凋亡水平比較（n=3）（注：與溶劑對(duì)照組相比,*為 P <0.05,**為 P<0.01）學(xué)檢測(cè)細(xì)胞凋亡（圖 1-1、1-2），如圖所示，隨 G有逐漸下降的趨勢(shì)，與對(duì)照組相比，當(dāng) GGA 濃度
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R543.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2708992