【摘要】：背景:動脈粥樣硬化(AS)是一種由血管損傷、固有免疫以及脂質(zhì)浸潤等多種因素引起的慢性炎癥性疾病,其終末表現(xiàn)為斑塊的形成與破裂,能夠引起心肌梗死、不穩(wěn)定心絞痛、卒中、外周血栓等多種心腦血管不良事件,嚴重危害了人類健康。miR-145是一種微小RNA,在心血管疾病中具有保護性作用。目前已經(jīng)證明,AS血管壁中miR-145水平持續(xù)性降低,然而其具體機制仍未明確。本研究擬從DNA水平,通過檢測組織以及細胞中的miR-145啟動子甲基化狀態(tài),闡明其調(diào)控機制。進一步探討miR-145的異常甲基化參與AS斑塊發(fā)生的作用及其機制。研究目的:1.檢測不同程度斑塊以及TNF-α處理的平滑肌細胞中miR-145啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)。2.篩選參與調(diào)控miR-145甲基化的相應甲基化酶或蛋白。3.體內(nèi)、體外水平使用5-aza(5-氮雜-脫氧胞嘧啶核)抑制甲基化后觀察miR-145表達變化。4.明確miR-145下游參與AS發(fā)生的靶基因。研究方法:1.動物分組及樣本獲取8周齡ApoE~(-/-)小鼠分為0、6、12、18、24周組,每組6只。分別給予高脂飲食飼養(yǎng)相應周數(shù)后使用CO_2麻醉法處死小鼠,分離并獲取小鼠升主動脈至腹主動脈處血管,包埋切片用于組織染色。其余部分用于DNA、RNA或蛋白提取。2.細胞培養(yǎng)和處理小鼠主動脈平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cell,VSMC)通過原代培養(yǎng)獲得。細胞以含10%FBS的D-MEM/F12培養(yǎng)基在37℃含5%CO_2條件下培養(yǎng)。根據(jù)不同實驗要求,細胞給予10ng/ml TNF-α處理24小時,或者TNF-α+5-aza(5μmol/ml)處理48小時。在CD137相關(guān)實驗中,VSMC先使用TNF-α(10ng/ml)預處理24小時增高膜表面CD137后,加入CD137L重組蛋白(10μg/ml)激活CD137通路。3.5-aza處理ApoE~(-/-)小鼠8周齡ApoE~(-/-)小鼠高脂飼養(yǎng)12周后隨機分為5-aza處理組和生理鹽水處理組分別腹腔注射5-aza(0.25mg/kg,每周3次)或等量生理鹽水,并持續(xù)高脂飼養(yǎng)12周。同時以C57BL/6小鼠高脂飼養(yǎng)24周作為野生型對照(WT)。4.亞硫酸鹽修飾后基因測序(BSP)與甲基化特異性PCR(MSP)提取組織或細胞DNA后,使用亞硫酸鹽進行修飾后通過基因測序檢測miR-145啟動子區(qū)甲基化位點。通過MethPrimer設(shè)計針對特定甲基化位點的MSP引物。采用PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳分析單個位點甲基化狀態(tài)。5.形態(tài)學染色、免疫組化及免疫熒光小鼠主動脈切片使用Masson染色鑒定斑塊面積以及壞死核心比例,通過Mac3免疫組化代表斑塊內(nèi)炎癥水平6.蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(Western blot)通過Western blot技術(shù)對相應蛋白指標CD137、DNMT3a、DNMT3b、TET2、DNMT1及NFATc1在細胞以及組織中進行半定量。7.染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)使用Ch IP技術(shù)獲得與TET2或DNMT1蛋白相結(jié)合的染色質(zhì),提取DNA后通過普通PCR或熒光定量PCR檢測mi R-145啟動子與相應蛋白結(jié)合能力。8.RNA提取以及定量PCRTrizol法提取組織或細胞中總RNA,使用加尾逆轉(zhuǎn)錄法獲得cDNA檢測檢測miR-145表達。使用普通逆轉(zhuǎn)錄法獲得cDNA用于檢測其他基因RNA水平。9.真核基因過表達以及沉默載體構(gòu)建通過PCR以及分子克隆構(gòu)建真核過表達載體p3×FLAG-NFATc1-3’UTR、p3×FLAG-NFATc1、p3×FLAG-CD137-3’UTR和p3×FLAG-CD137用于驗證miR-145的靶點。構(gòu)建Plenti-NFATc1和PLKO.1-sh-NFATc1慢病毒載體用以分別過表達、沉默NFATc1。Plenti-TET2載體用來過表達TET2。10.雙熒光素酶報告基因?qū)嶒瀸⒑衜iR-145靶位點的CD137或NFATc1的3’-端非編碼區(qū)及相應突變序列構(gòu)建到Psicheck2載體中,通過共轉(zhuǎn)染miR-145擬似物或抑制物并檢測熒光活性驗證目的基因靶點。11.酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)采用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)基上清或小鼠血清中IL-1β含量。研究結(jié)果:1.ApoE~(-/-)小鼠主動脈中miR-145表達水平隨著斑塊程度增高而下降Masson染色以及Mac3免疫組化顯示,在0,12,24周高脂飼養(yǎng)的小鼠中斑塊程度不斷增高,壞死核心增大且炎癥程度增多。Q-PCR顯示組織中miR-145表達水平隨著斑塊進展不斷下降。2.斑塊血管以及TNF-α刺激下VSMC中miR-145啟動子區(qū)甲基化程度增高BSP以及MSP顯示,miR-145啟動子區(qū)甲基化水平隨著斑塊程度進展不斷增高,另外TNF-α模擬炎癥環(huán)境同樣可以誘導VSMC中mi R-145啟動子高甲基化的形成。3.DNMT1和TET2介導了炎癥中mi R-145啟動子的異常甲基化發(fā)生通過篩選甲基化相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn),DNMT1和TET2在斑塊血管以及炎癥處理的VSMC中表達量以及活性明顯改變,而通過沉默表達DNMT1或過表達TET2后均可逆轉(zhuǎn)miR-145啟動子的高甲基化,使其表達增高。4.CD137/NFATc1通路是miR-145下游的靶基因通過生物信息學預測我們發(fā)現(xiàn)CD137/NFATc1可能是miR-145的下游靶基因。在VSMC中轉(zhuǎn)入miR-145的擬似物或抑制物分別能夠顯著降低和升高CD137/NFATc1兩蛋白的表達。通過構(gòu)建相應靶點的載體證明了CD137/NFATc1是miR-145的下游靶基因。研究結(jié)論:炎癥通過DNMT1和TET2介導VSMC中miR-145啟動子區(qū)異常高甲基化抑制其表達,從而使下游CD137/NFATc1信號通路激活促進斑塊形成。
【圖文】：

圖 1.1 不同程度斑塊模型的建立及鑒定A：Masson 染色顯示斑塊壞死核心與纖維帽。B：相應斑塊的面積和壞死核心大小測定p<0.05）。C、D：Mac3 的陽性率及統(tǒng)計分析（n=5, P<0.05）。Figure1.1 Establishment and identification of plaques in different degreeA: Masson staining exhibited the necrotic core and fibrous cap. B: Area of plaque and necroC and D: The immunohistochemistry of Mac3 in plaques.4.2 斑塊程度與 miR-145 表達的關(guān)系通過熒光定量 PCR 檢測不同程度斑塊血管中 miR-145 的表達。圖 1.2 斑塊及 TNF-α 刺激下平滑肌細胞中 miR-145 的表達A：不同程度斑塊中 miR-145 的表達量，，（n=6, p<0.05）。B：不同濃度 TNF-α 處理后原代平

圖 1.1 不同程度斑塊模型的建立及鑒定A：Masson 染色顯示斑塊壞死核心與纖維帽。B：相應斑塊的面積和壞死核心大小測定（p<0.05）。C、D：Mac3 的陽性率及統(tǒng)計分析（n=5, P<0.05）。Figure1.1 Establishment and identification of plaques in different degreeA: Masson staining exhibited the necrotic core and fibrous cap. B: Area of plaque and necrotic cC and D: The immunohistochemistry of Mac3 in plaques.4.2 斑塊程度與 miR-145 表達的關(guān)系通過熒光定量 PCR 檢測不同程度斑塊血管中 miR-145 的表達。
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R543.5

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本文編號：2708821