【摘要】：研究背景心血管疾病以其高發(fā)病率,高死亡率和高致殘率嚴重危害人類的身體健康。血管穩(wěn)態(tài)是心血管病發(fā)生的重要基礎。在血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)的組成中,血管內(nèi)皮細胞是血管穩(wěn)態(tài)的重要組成部分。血管內(nèi)皮細胞是循環(huán)血流與血管壁之間的重要屏障。生理狀態(tài)下,血管內(nèi)皮細胞發(fā)揮著重要的生理功能,如合成和釋放血管活性介質、協(xié)助血管內(nèi)外的物質交換等等。血流剪切力是血管內(nèi)皮細胞直接承受的一種外界切應力,對血管結構和功能變化具有重要的影響,近年來的研究表明,高梯度的血流剪切力可以提高內(nèi)皮細胞內(nèi)皮型一氧化氮合酶(e NOS)表達,增加一氧化氮(nitric oxide,NO)釋放,誘導血管舒張,抵制動脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生,對血管具有保護作用。低血流剪切力被認為是與AS發(fā)生發(fā)展以及斑塊破裂重要的相關力學因素之一。本研究分為兩部分,分別研究剪切力在氧化應激條件下對血管內(nèi)皮細胞功能的影響以及低剪切力調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞自噬水平的分子機制。第I部分:剪切力對氧化應激狀態(tài)內(nèi)皮細胞一氧化氮合酶表達的影響氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)是泡沫細胞形成的關鍵,同時可以通過促進巨噬細胞的增殖退化、促進血管收縮以及損傷血管內(nèi)皮等機制最終導致AS的發(fā)生。NO是一種由血管內(nèi)皮細胞分泌的重要活性物質,NO在調(diào)節(jié)血管張力、降低脂質水平、抑制粘附分子、血小板聚集和血管平滑肌細胞(VSMCs)的表達等方面起著重要作用。NO生成主要受e NOS的影響,其生成受損是內(nèi)皮細胞功能紊亂的重要標志之一。但剪切力對ox-LDL作用下的內(nèi)皮細胞e NOS表達的影響目前研究較少。研究目的探討剪切力對ox-LDL作用下的內(nèi)皮細胞e NOS表達的影響。研究方法將HAEC分為對照組和實驗組,2組均采用精密輸液泵施加剪切力,實驗組同時給予ox LDL 100μg/m L共刺激。分別對兩組細胞施加正常剪切力,低剪切力以及高剪切力的刺激,剪切力的大小分別為10、4、15 dyne/cm2。采用q-PCR及Western Blot技術檢測e NOS m RNA和蛋白的表達,采用硝酸鹽還原酶法測定NO含量。實驗結果在實驗組、對照組中,NO含量、e NOS m RNA表達水平以及e NOS蛋白的表達量4 dyne/cm2組均明顯低于10 dyne/cm2組,15 dyne/cm2組均明顯高于10 dyne/cm2組和4 dyne/cm2組;ox-LDL刺激組10 dyne/cm2亞組、4 dyne/cm2亞組及15 dyne/cm2亞組NO含量vs對照組相同亞組NO含量分別為:(1.09±0.33)μmol/L vs.(2.27±0.90)μmol/L、(0.20±0.08)μmol/L vs.(0.71±0.36)μmol/L、(3.03±0.71)μmol/L vs.(4.93±1.16)μmol/L。ox-LDL刺激組10 dyne/cm2亞組、4dyne/cm2亞組及15 dyne/cm2亞組e NOS m RNA vs對照組相同亞組e NOS m RNA分別為:(0.65±0.20)vs.(1.11±0.32)、(0.22±0.13)vs.(0.49±0.22)、(1.05±0.22)vs.(1.90±0.56)。ox-LDL刺激組10 dyne/cm2亞組、4 dyne/cm2亞組及15 dyne/cm2亞組e NOS蛋白vs對照組相同亞組e NOS蛋白分別為:(0.50±0.19)vs.(1.10±0.26)、(0.18±0.52)vs.(0.62±0.19)、(1.07±0.20)vs.(1.70±0.38)。即ox-LDL刺激組10dyne/cm2亞組、4 dyne/cm2亞組及15 dyne/cm2亞組NO含量,e NOS m RNA,e NOS蛋白均明顯低于無ox-LDL刺激的相同亞組,差異具有統(tǒng)計學意義(P㩳0.05)。4 dyne/cm2組NO下降率明顯高于10 dyne/cm2組,15 dyne/cm2組e NOS蛋白下降率、e NOS m RNA下降率和NO下降率明顯低于4 dyne/cm2組,差異有統(tǒng)計學意義(P㩳0.05)。研究結論高剪切力可降低ox-LDL對內(nèi)皮細胞e NOS活性的抑制作用,而低梯度剪切力可增強ox-LDL對內(nèi)皮細胞e NOS活性的抑制作用。第II部分:mi R-21調(diào)節(jié)低剪切力誘導的內(nèi)皮細胞自噬的分子機制自噬是細胞在外界環(huán)境因素的影響下,細胞對其內(nèi)部受損的細胞器、錯誤折疊的蛋白質和侵入其內(nèi)的病原體進行降解的生物學過程。研究發(fā)現(xiàn),低血流剪切力可以影響內(nèi)皮細胞的自噬水平,然而低血流剪切力影響內(nèi)皮細胞的自噬水平的分子機制目前尚不明確。微小RNA(mi RNAs)是一類內(nèi)源性的非編碼RNA,長度大約為18-25個核苷酸,可以通過促進m RNA的降解或抑制翻譯在轉錄后水平上調(diào)節(jié)靶基因的表達。Mi RNA在體內(nèi)發(fā)揮許多生物學功能,例如參與細胞的增殖、分化、死亡以及組織的發(fā)育等。研究表明,Micro RNAs在剪切力調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞的自噬過程中發(fā)揮著十分重要的作用。然而,micro RNAs在生物作用力下調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞的自噬水平方面的作用以及分子機制目前尚不明確。微小RNA-21(Mi R-21)是迄今為止研究最為廣泛的微小RNA之一。通過高通量篩選發(fā)現(xiàn),當內(nèi)皮細胞受到剪切力的刺激時,細胞中許多micro RNA的表達水平都會發(fā)生不同程度的變化,其中,mi R-21的變化最為明顯。因此,我們推測剪切力可能通過mi R-21影響內(nèi)皮細胞自噬水平。本研究以人臍靜脈內(nèi)皮細胞為研究對象,分析mi R-21對低剪切力條件下臍靜脈內(nèi)皮細胞的自噬水平的作用機制。研究目的研究mi R-21對低剪切力條件下臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)的自噬水平的作用機制。研究方法體外建立剪切力作用的內(nèi)皮細胞模型,并在此基礎上向內(nèi)皮細內(nèi)轉染mi R-21 mimics、mi R-21 inhibitor后,利用q-PCR,Western Blot,細胞免疫熒光以及透射電鏡技術檢測mi R-21對內(nèi)皮細胞自噬水平的影響。研究結果利用Western Blot發(fā)現(xiàn),與0 dyne/cm2相比,低剪切力組的HUVECs P62的表達水平由1.43±0.75下降到0.25±0.05,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達水平由1.64±0.22提高到4.8±0.80(P0.05),即低剪切力可以顯著提高內(nèi)皮細胞的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達水平,P62的表達水平則降低(P0.05)。在低剪切力的基礎之上,采用mi R-21 mimics及mi R-21 inhibitor刺激后,與低剪切力組相比,mimics組P62的表達水平由0.25±0.05提高到0.40±0.05,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達水平4.80±0.80下降到2.97±0.35(P0.05),inhibitor組P62的表達水平由0.54±0.04下降到0.33±0.42,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達水平由4.60±0.44上升到7.00±1.32(P0.05),即mimics組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達顯著降低,P62表達顯著升高(P0.05);而inhibitor組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達顯著升高,P62表達顯著降低(P0.05)。利用細胞免疫熒光發(fā)現(xiàn),與0 dyne/cm2相比,低剪切力組的LC3Ⅱ陽性累積光密度值由448.79±118.47升高到1569.16±617.17(P0.05),即低剪切力可以顯著提高內(nèi)皮細胞中LC3熒光斑點數(shù)(P0.05)。在低剪切力的基礎之上,采用mi R-21 mimics及mi R-21 inhibitor刺激后,與低剪切力組相比,mimics組LC3Ⅱ陽性累積光密度值由1569.16±617.17下降到381.33±108.27(P0.05),inhibitor組LC3Ⅱ陽性累積光密度值由3245.76±1047.90上升到16092.77±2215.37(P0.05),即mimics組LC3熒光斑點數(shù)顯著降低,(P0.05);而inhibitor組LC3熒光斑點數(shù)顯著升高(P0.05)。利用透射電鏡發(fā)現(xiàn),低剪切力可以顯著提高內(nèi)皮細胞中自噬小體的數(shù)量。在低剪切力的基礎之上,采用mi R-21 mimics及mi R-21 inhibitor刺激后,與低剪切力組比較,mimics組內(nèi)皮細胞中自噬小體的數(shù)量顯著降低;而inhibitor組自噬小體的數(shù)量顯著升高。研究結論mi R-21參與介導低剪切力調(diào)節(jié)人臍靜脈內(nèi)皮細胞自噬的作用。
【圖文】：

圖 1 剪切力對 eNOS 蛋白表達的影響注：與正常剪切力組相比，P*<0.05；與正常剪切力和低剪切力組相比較，2.1.2 剪切力對 eNOS mRNA 表達的影響當細胞給予正常剪切力、低剪切力和高剪切力的刺激后，eNOS mR

剪切力對eNOSmRNA表達的影響
【學位授予單位】：濟南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R54

【參考文獻】

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本文編號：2708372