發(fā)布時(shí)間：2020-06-11 19:50

【摘要】：研究背景心血管疾病以其高發(fā)病率,高死亡率和高致殘率嚴(yán)重危害人類(lèi)的身體健康。血管穩(wěn)態(tài)是心血管病發(fā)生的重要基礎(chǔ)。在血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)的組成中,血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管穩(wěn)態(tài)的重要組成部分。血管內(nèi)皮細(xì)胞是循環(huán)血流與血管壁之間的重要屏障。生理狀態(tài)下,血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮著重要的生理功能,如合成和釋放血管活性介質(zhì)、協(xié)助血管內(nèi)外的物質(zhì)交換等等。血流剪切力是血管內(nèi)皮細(xì)胞直接承受的一種外界切應(yīng)力,對(duì)血管結(jié)構(gòu)和功能變化具有重要的影響,近年來(lái)的研究表明,高梯度的血流剪切力可以提高內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮型一氧化氮合酶(e NOS)表達(dá),增加一氧化氮(nitric oxide,NO)釋放,誘導(dǎo)血管舒張,抵制動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生,對(duì)血管具有保護(hù)作用。低血流剪切力被認(rèn)為是與AS發(fā)生發(fā)展以及斑塊破裂重要的相關(guān)力學(xué)因素之一。本研究分為兩部分,分別研究剪切力在氧化應(yīng)激條件下對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響以及低剪切力調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬水平的分子機(jī)制。第I部分:剪切力對(duì)氧化應(yīng)激狀態(tài)內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶表達(dá)的影響氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)是泡沫細(xì)胞形成的關(guān)鍵,同時(shí)可以通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖退化、促進(jìn)血管收縮以及損傷血管內(nèi)皮等機(jī)制最終導(dǎo)致AS的發(fā)生。NO是一種由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的重要活性物質(zhì),NO在調(diào)節(jié)血管張力、降低脂質(zhì)水平、抑制粘附分子、血小板聚集和血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)的表達(dá)等方面起著重要作用。NO生成主要受e NOS的影響,其生成受損是內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂的重要標(biāo)志之一。但剪切力對(duì)ox-LDL作用下的內(nèi)皮細(xì)胞e NOS表達(dá)的影響目前研究較少。研究目的探討剪切力對(duì)ox-LDL作用下的內(nèi)皮細(xì)胞e NOS表達(dá)的影響。研究方法將HAEC分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,2組均采用精密輸液泵施加剪切力,實(shí)驗(yàn)組同時(shí)給予ox LDL 100μg/m L共刺激。分別對(duì)兩組細(xì)胞施加正常剪切力,低剪切力以及高剪切力的刺激,剪切力的大小分別為10、4、15 dyne/cm2。采用q-PCR及Western Blot技術(shù)檢測(cè)e NOS m RNA和蛋白的表達(dá),采用硝酸鹽還原酶法測(cè)定NO含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果在實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組中,NO含量、e NOS m RNA表達(dá)水平以及e NOS蛋白的表達(dá)量4 dyne/cm2組均明顯低于10 dyne/cm2組,15 dyne/cm2組均明顯高于10 dyne/cm2組和4 dyne/cm2組;ox-LDL刺激組10 dyne/cm2亞組、4 dyne/cm2亞組及15 dyne/cm2亞組NO含量vs對(duì)照組相同亞組NO含量分別為:(1.09±0.33)μmol/L vs.(2.27±0.90)μmol/L、(0.20±0.08)μmol/L vs.(0.71±0.36)μmol/L、(3.03±0.71)μmol/L vs.(4.93±1.16)μmol/L。ox-LDL刺激組10 dyne/cm2亞組、4dyne/cm2亞組及15 dyne/cm2亞組e NOS m RNA vs對(duì)照組相同亞組e NOS m RNA分別為:(0.65±0.20)vs.(1.11±0.32)、(0.22±0.13)vs.(0.49±0.22)、(1.05±0.22)vs.(1.90±0.56)。ox-LDL刺激組10 dyne/cm2亞組、4 dyne/cm2亞組及15 dyne/cm2亞組e NOS蛋白vs對(duì)照組相同亞組e NOS蛋白分別為:(0.50±0.19)vs.(1.10±0.26)、(0.18±0.52)vs.(0.62±0.19)、(1.07±0.20)vs.(1.70±0.38)。即ox-LDL刺激組10dyne/cm2亞組、4 dyne/cm2亞組及15 dyne/cm2亞組NO含量,e NOS m RNA,e NOS蛋白均明顯低于無(wú)ox-LDL刺激的相同亞組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㩳0.05)。4 dyne/cm2組NO下降率明顯高于10 dyne/cm2組,15 dyne/cm2組e NOS蛋白下降率、e NOS m RNA下降率和NO下降率明顯低于4 dyne/cm2組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㩳0.05)。研究結(jié)論高剪切力可降低ox-LDL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞e NOS活性的抑制作用,而低梯度剪切力可增強(qiáng)ox-LDL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞e NOS活性的抑制作用。第II部分:mi R-21調(diào)節(jié)低剪切力誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞自噬的分子機(jī)制自噬是細(xì)胞在外界環(huán)境因素的影響下,細(xì)胞對(duì)其內(nèi)部受損的細(xì)胞器、錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)和侵入其內(nèi)的病原體進(jìn)行降解的生物學(xué)過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn),低血流剪切力可以影響內(nèi)皮細(xì)胞的自噬水平,然而低血流剪切力影響內(nèi)皮細(xì)胞的自噬水平的分子機(jī)制目前尚不明確。微小RNA(mi RNAs)是一類(lèi)內(nèi)源性的非編碼RNA,長(zhǎng)度大約為18-25個(gè)核苷酸,可以通過(guò)促進(jìn)m RNA的降解或抑制翻譯在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。Mi RNA在體內(nèi)發(fā)揮許多生物學(xué)功能,例如參與細(xì)胞的增殖、分化、死亡以及組織的發(fā)育等。研究表明,Micro RNAs在剪切力調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的自噬過(guò)程中發(fā)揮著十分重要的作用。然而,micro RNAs在生物作用力下調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的自噬水平方面的作用以及分子機(jī)制目前尚不明確。微小RNA-21(Mi R-21)是迄今為止研究最為廣泛的微小RNA之一。通過(guò)高通量篩選發(fā)現(xiàn),當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受到剪切力的刺激時(shí),細(xì)胞中許多micro RNA的表達(dá)水平都會(huì)發(fā)生不同程度的變化,其中,mi R-21的變化最為明顯。因此,我們推測(cè)剪切力可能通過(guò)mi R-21影響內(nèi)皮細(xì)胞自噬水平。本研究以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象,分析mi R-21對(duì)低剪切力條件下臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的自噬水平的作用機(jī)制。研究目的研究mi R-21對(duì)低剪切力條件下臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的自噬水平的作用機(jī)制。研究方法體外建立剪切力作用的內(nèi)皮細(xì)胞模型,并在此基礎(chǔ)上向內(nèi)皮細(xì)內(nèi)轉(zhuǎn)染mi R-21 mimics、mi R-21 inhibitor后,利用q-PCR,Western Blot,細(xì)胞免疫熒光以及透射電鏡技術(shù)檢測(cè)mi R-21對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞自噬水平的影響。研究結(jié)果利用Western Blot發(fā)現(xiàn),與0 dyne/cm2相比,低剪切力組的HUVECs P62的表達(dá)水平由1.43±0.75下降到0.25±0.05,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達(dá)水平由1.64±0.22提高到4.8±0.80(P0.05),即低剪切力可以顯著提高內(nèi)皮細(xì)胞的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達(dá)水平,P62的表達(dá)水平則降低(P0.05)。在低剪切力的基礎(chǔ)之上,采用mi R-21 mimics及mi R-21 inhibitor刺激后,與低剪切力組相比,mimics組P62的表達(dá)水平由0.25±0.05提高到0.40±0.05,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達(dá)水平4.80±0.80下降到2.97±0.35(P0.05),inhibitor組P62的表達(dá)水平由0.54±0.04下降到0.33±0.42,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達(dá)水平由4.60±0.44上升到7.00±1.32(P0.05),即mimics組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)顯著降低,P62表達(dá)顯著升高(P0.05);而inhibitor組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)顯著升高,P62表達(dá)顯著降低(P0.05)。利用細(xì)胞免疫熒光發(fā)現(xiàn),與0 dyne/cm2相比,低剪切力組的LC3Ⅱ陽(yáng)性累積光密度值由448.79±118.47升高到1569.16±617.17(P0.05),即低剪切力可以顯著提高內(nèi)皮細(xì)胞中LC3熒光斑點(diǎn)數(shù)(P0.05)。在低剪切力的基礎(chǔ)之上,采用mi R-21 mimics及mi R-21 inhibitor刺激后,與低剪切力組相比,mimics組LC3Ⅱ陽(yáng)性累積光密度值由1569.16±617.17下降到381.33±108.27(P0.05),inhibitor組LC3Ⅱ陽(yáng)性累積光密度值由3245.76±1047.90上升到16092.77±2215.37(P0.05),即mimics組LC3熒光斑點(diǎn)數(shù)顯著降低,(P0.05);而inhibitor組LC3熒光斑點(diǎn)數(shù)顯著升高(P0.05)。利用透射電鏡發(fā)現(xiàn),低剪切力可以顯著提高內(nèi)皮細(xì)胞中自噬小體的數(shù)量。在低剪切力的基礎(chǔ)之上,采用mi R-21 mimics及mi R-21 inhibitor刺激后,與低剪切力組比較,mimics組內(nèi)皮細(xì)胞中自噬小體的數(shù)量顯著降低;而inhibitor組自噬小體的數(shù)量顯著升高。研究結(jié)論mi R-21參與介導(dǎo)低剪切力調(diào)節(jié)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞自噬的作用。
【圖文】：

圖 1 剪切力對(duì) eNOS 蛋白表達(dá)的影響注：與正常剪切力組相比，P*<0.05；與正常剪切力和低剪切力組相比較，2.1.2 剪切力對(duì) eNOS mRNA 表達(dá)的影響當(dāng)細(xì)胞給予正常剪切力、低剪切力和高剪切力的刺激后，eNOS mR

剪切力對(duì)eNOSmRNA表達(dá)的影響
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R54

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2708372